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学习流式细胞术前必须懂的几个概念,一条龙

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发表于 2018-7-26 14:23:28 | 显示全部楼层 |阅读模式

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计数
流式细胞仪可在每秒可检测成百上千个事件,最终获取到高数量级的细胞,从而在比例上,会比手工计数准确的多。
然而,对于精确的绝对计数,流式细胞仪大多需要使用标准化微球(即已知浓度的微球), 当仪器记录了已知数量的微球时,可通过获取的微球数量,反推获取的样本体积,从而能够计算出样本内的细胞绝对数。 另一种方法是使用内置在流动池中的校准体积系统,可直接吸入指定体积的液体,实现绝对计数。

光信号
除了计数颗粒外,FCM还可以获取它们的物理、化学或生物特性。 FCM利用的粒子/细胞的主要物理特性是它们衍射、反射和折射激光束的相干单色光的能力。市场上有不同类型的激光器。 流式细胞仪最初配备有使用氩、氪、氦-氖或氦 - 镉的气体激光器,有些需要冷却系统。 固态激光器是晶体[红宝石,钇铝(YAG)]或诸如钛或铬的离子。 最新有些仪器使用基于半导体的激光二极管,类似于发光二极管(LED)。
当窄且聚焦的相干激光遇到细胞/粒子(所谓的事件)时,其衍射强度与“事件”的大小成比例。 流式细胞仪配备有光电二极管,可收集由激光束路径中的细胞衍射的前向散射(FSC)光。 仪器还配备了一个装置(遮光板),当没有粒子穿过它时,它阻挡激光。 当有细胞进入激光器的路径时,光束的宽度与细胞的大小成比例,FSC光电二极管可以收集这些光信号,并转换为电子信号。

同时,第二个探测器(光电二极管或光电倍增管(PMT))以一定角度收集由细胞/颗粒表面以及其内部任何表面(即细胞器、囊泡、颗粒等)反射的光,在激光束的路径的侧向,即侧向散射光。 因此,该侧向散射光(SSC)信号的强度将与细胞的颗粒度成比例。 通常,在血液样本中,没有细胞核的红细胞将SSC信号很弱,而由颗粒多的粒细胞产生SSC更强。 仪器之间的散射信号模式会略有不同,具体取决于SSC探测器的角度和通道的数量。

检测器的电压也将改变所收集的光的强度。在散射光信号上,对小颗粒(如血小板或更小的微颗粒)需要加大电压,而对于大细胞(如粒细胞)可用较低的电压。

化学参数也可以通过流式细胞仪测量,通常都是基于荧光染料的性质。荧光染料是能够吸收特定波长的光并在更高和确定的波长下重新发射光信号的化学物质。以下是常用的荧光染料种类:
Fig1.png
为了收集来自每种荧光染料的发射光,在每个信号由专用PMT记录之前,流式细胞仪还配备有二向色镜和带通滤波器。二向色镜反射特定波长的光,同时让所有其他光通过,它们与发射源成一定角度,使反射光束与镜子成90°角并朝向相关的PMT。而特定波长的滤光器在PMT之前缩小收集光束波长范围,只收集峰值附近的荧光信号,避免其它波长的干扰。


信号收集
发送到PMT的信号非常低,需要被放大。通过应用增益值可以获得线性放大,通常用于FSC和SSC。

每个信号由模拟/数字转换器(ADC)电子转换,产生0或1的二进制信号。通常,无信号或低信号为0,高信号为1。收集信号的灵敏度可通过增加比特数来提高。例如,采用1bit的话,0到10V之间的信号只能分为两档,0到5V之间设为0,5到10V之间设为1;而如果采用3bit数字化,则可将0到10V范围分成八个级别,如下图:
Fig2.png


通常,流式细胞仪使用14或20位组合,其产生16384或1048576个通道。第二种组合为弱信号提供了更好的区分,因为这些信号的图形坐标表示通常使用对数,将坐标分为4个区间的话,14bit配置在第一个区间只能提供16个通道,20bit配置则可提供900个通道,两种配置在高电压下差异小,但在低值时就体现出差异,这说明选择PMT参数对于检测弱荧光很重要,而电压设置合理也尤为重要。
Fig3.png

信号显示,即图形展示
流式软件显示获取的信号,最常用的图形是单参数的直方图和双参数的散点图。
直方图如下,每个峰大多呈高斯分布,CV值应在可控范围:
屏幕快照 2018-07-26 上午11.05.20.png

散点图如下a、b、c,可通过不同颜色的门,将不同的细胞更明显地区分开来,d图和e图分别是密度图(或伪彩色图)、等高线图:
屏幕快照 2018-07-26 上午11.05.48.png


补偿
荧光染料的发射光谱显示为半高斯曲线,其最大峰值决定了在PMT之前放置的带通滤波器的选择,如下图:
屏幕快照 2018-07-26 上午11.26.05.png
然而,这些发射光谱经常重叠,因此需要想办法去除这些污染信号,所以要通过减去每个荧光通道中重叠信号的百分比来实现:
屏幕快照 2018-07-26 上午11.27.21.png

补偿的调节,需要对细胞或微球进行逐个荧光单染,然后在每个相邻波长的荧光通道中检查荧光渗漏,调整补偿百分比以去除重叠信号,在此步骤中,非常重要的,必须同时具有阴性细胞群,以提供参考的基线信号。在检查补偿是否合适的图形显示上,建议用双指数或Logicle显示,可以更好的显示某些通过不可避免的扩散或喇叭效应,如下图,使补偿调节的中位数能够对得更准确:
屏幕快照 2018-07-26 上午11.32.52.png

目前常用的补偿微球是用抗小鼠免疫球蛋白的抗体包被的,所以能够结合各种抗体,因此无论什么抗体,补偿微球都能染出阳性峰。用单染微球和软件的自动补偿向导调节补偿后,很多朋友用单染微球调节好补偿之后,发现还是不准,一个原因是微球和细胞大小和颗粒度的不同,另一个原因还是没考虑到周边各通道的综合效应。其实更合理的还是用FMO(荧光减一)对照调节会更准确,FMO大多还是用于设门更多,调节补偿在成本上可能还是吃不消。

流式细胞仪的设置
对于任何给定的实验,必须事先定义仪器的参数,必须对PMT进行调整,以使记录的信号不会超出最大坐标限。 一个比较好的办法是使用裂解后未染色的外周血样本来调整所有PMT,使得超过85%的细胞都能显示在第一个坐标限内。
尽管目前的仪器通常非常稳定,但必须定期检查激光与流动池的对齐情况,这一般通过特定的校准微球,根据其峰值变化,绘制Levy-Jennings图,进行跟踪和质控。
鞘液通常是等渗溶液,但由于该液体通道与其引导的细胞悬浮液之间没有接触,因此也可以使用水。必须要注意的是,鞘液必须完全没有任何可以产生光信号的粒子。
仪器的液路必须保持非常干净,建议使用含氯漂白剂和蒸馏水进行定期清洗。

Panel的设计
多参数FCM具有能够同时测试细胞的多个招标,8和10色流式细胞仪现在经常提供多达10或12个参数,这在用于诊断血液恶性肿瘤的免疫表型分析中非常有价值,特别是当仅有少量样品如细针抽吸物(FNA)或脑脊液时。在设计方案时需要考虑:一是如何尽量用多个标记区分出最多的不同亚群,例如粒细胞、单核细胞,淋巴细胞和干祖细胞。二是将几种标记组合在一起,观察它们在相同细胞上的共表达,从而了解其成熟或激活状态。无论哪种情况,正确选择单克隆抗体及其荧光染料是很重要的。而荧光染料的选择上,原则上是弱表达的标记选择高亮度的荧光素,高表达的标记选择弱荧光素,但同时还需考虑到其与周边通道荧光的补偿。

样本处理
流式需要使用单细胞悬液的样本,目前大多数地方都是用EDTA或肝素,一般收集之后需要在72小时内处理完,在医院内大多不是问题,但对于不少第三方检验机构,可能就成了难题。脑脊液样本更是要求4度、24小时内处理,以避免细胞损失。此外,一些肿瘤细胞如高级别B细胞淋巴瘤或骨髓瘤中的浆细胞可能更容易发生细胞凋亡,时间上的要求同样严格。
流式中文网的1型和2型保存液,正是为此而原研。1型保存液适合所有类型的样本,尤其是组织和脑脊液,保存时间长达21天,缺点是由于缓释固定作用,一开始会使FSC和小部分的抗原表达强度略降低,但测试数百例样本发现表达强度第一次降低后,便可保持稳定,而且对比例无影响。2型保存液是最近两个月新推出的,适合外周血和骨髓,有效减少细胞凋亡和死亡,保持FSC和所有抗原表达强度,缺点是只能保存7天。有兴趣的朋友可识别下面的二维码咨询:
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骨髓样品被外周血稀释,不会影响原始细胞的表型,但是会影响其比例和绝对数,而这对于诊断白血病和MDS很重要,对于干细胞移植前计数动员CD34 +祖细胞也很重要。

染色使用的抗体组合,可以每周一配制好混合抗体,能够避免每次加抗体容易疏忽加错的问题,但必须在黑暗中小心存放并连续几天验证使用。配制的时候,注意抗体量要最佳,并且配制环境避光、避免枪头污染。目前市场上已经有厂家提供定制的或通用的即用型抗体组合,或含有冻干或干燥抗体的单根流式管。

对于大多数应用,全血或骨髓是首选样品,样本中的红细胞需要使用裂解液裂解。裂解液的配方有很多,最常用、最经典的还是氯化铵(NH4Cl)配方(流式中文网有粉剂,能长期保存,即用即配,同样可通过上面的二维码进行咨询)。可以孵育完直接上机,以避免洗涤丢失细胞,但是为了使非特异性染色最小化,建议使用较少量的抗体(根据滴定结果而定)。不过检测表面免疫球蛋白时,必须进行预先大体积洗涤3次以去除血浆中的抗体影响。另外,当需要破膜检测胞内或核内抗原时,洗涤步骤也是必需的。如果需要检测稀有群体,可以在孵育前进行较大样品的大体积裂解,然后离心以增加细胞浓度。需要注意的是,每个洗涤步骤都可能随机丢失细胞,可能会改变细胞群体的比例。还需要提一下的是,一些裂解制剂含有固定剂,可固定细胞膜稳定染色,这在大批样本染色时比较好,不过,即使在固定之后,也必须防止样品暴露于光照下,因为荧光染料怕光。


参考文献:Porwit, A., & Béné, M. (Eds.). (2018). Multiparameter Flow Cytometry in the Diagnosis of Hematologic Malignancies. Cambridge: Cambridge University Press. doi:10.1017/9781316218549
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