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今天重口味,谈谈流式在『法医学』上的应用现状和展望

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发表于 2018-10-10 15:56:32 | 显示全部楼层 |阅读模式

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今天这个主题,可能很多人都想不到,流式还能用在法医学上。流式的快速、高通量,使得其应用领域非常之广。那么一起来聊聊这些重口味的内容吧。

DNA降解速度和死亡时间
为确定死者的死亡时间,应采用哪些最佳和最可靠的样本材料和调查方法?目前有好几种生物、物理和化学指标来确定死后时间间隔(PMI),但是,大多数都不完全准确(Hunter MC, Pozhitkov AE, Noble PA. Accurate predictions of postmortem interval using linear regression analyses of gene meter expression data. Forensic science international. 2017 Jun 30;275:90-10)。 在刑事和民事调查中,准确预测PMI对调查与人寿保险单相关的欺诈、确定嫌疑人与受害人之间的时间关系以及从嫌疑人名单中删除人员至关重要。
在法医学中,用于测定PMI最普遍的方法是基于一些物理参数,如尸僵、尸冷、尸斑、死后分解等。但是,这些方法没法给出确切的PMI。因此,现在注意力已转向法医病理学,以更准确地确定自死亡以来所经过的时间。法医病理学基于测量血液、脑脊液、玻璃体液和房水中化学物质的变化,这些化学物质的变化与死亡后身体崩解所经过的时间成正比,不过,这些参数也可能受到生前的疾病、死亡原因、样本的可用性和纯度和环境因素等因素的影响。通常,用于研究PMI的参数是氯离子、钾、天冬氨酸氨基转移酶的浓度、非蛋白质百分比和白细胞的细胞数量变化、腐败期间的蛋白质降解和心肌肌钙蛋白的浓度等等。
除此之外,还有研究根据DNA降解的模式随着时间的变化来估计PMI。使用不同的技术分析不同的生物样本,如玻璃体液、阴道冲洗液、死者的组织,以调查法医案件。 然而,大多数技术要么不具有成本效益,要么方法繁琐、耗时,或者需要过高的专业能力。
流式细胞术是一种新兴技术,广泛用于临床病理学领域的单细胞分析。 流式细胞术是一种基于激光的技术,可以非常高的速率对通过的粒子物理和化学性质进行多参数分析。 荧光染料的使用进一步增强了流式细胞仪的检测能力,使得能够检测的指标大大得到扩展,从细胞大小(基于细胞的形态和复杂性)到细胞计数,甚至蛋白质表达分析、蛋白质翻译后修饰、细胞周期分析、细胞增殖、细胞死亡、细胞凋亡分析以及细胞分选。流行细胞术在法医学领域的首次应用由Cina完成,她从已知PMI的尸体脾脏组织中,用流式检测DNA降解速度和PMI之间的关系(Cina SJ. Flow cytometric evaluation of DNA degradation: a predictor of postmortem interval?. The American journal of forensic medicine and pathology. 1994 Dec;15(4):300-2.)。后来,Nunno等人使用流式细胞术,从死者的脾脏和肝脏取得的样本以及在犯罪现场发现的血液,以确定DNA降解与死亡后流逝的时间之间的关系,并使用流式细胞仪检测哪些器官组织可以作为最佳样本(Di Nunno NR, et al. Is flow cytometric evaluation of DNA degradation a reliable method to investigate the early postmortem period?. The American journal of forensic medicine and pathology. 1998 Mar 1;19(1):50-3.)。最后认为,肝脏组织是最好的样本,因为肝脏细胞DNA降解速度与死亡后经过的时间之间几乎呈线性相关(Di Nunno N, et al. What is the best sample for determining the early postmortem period by on-the-spot flow cytometry analysis?. The American journal of forensic medicine and pathology. 2002 Jun 1;23(2):173-80.)。
在William等人2015的一项研究中,对死者的脑和脾组织样本进行了分析,通过流式分析了在两个不同温度(21和4摄氏度)下96小时内DNA降解度,发现与脾脏相比,脑组织的DNA降解速度的变异更小,这表明脑组织是评估死亡时间的更好选择,见下图:

                               
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性侵犯
在性侵犯的情况下,有一些方法,如优先裂解和密度梯度离心,可分离出精子和阴道细胞。然而,这些方法步骤多,分离过程中容易导致污染以及精子细胞的损失。如果只有少量的精子细胞和大量的阴道细胞,那么犯罪者的情况识别就更加困难了。 Schoell等人。建议使用流式细胞仪分选精子细胞和阴道细胞(阴道细胞为二倍体,精子细胞为单倍体),即使只有微量精子存在,也能够有效分离。 Nunno等人还使用20名至少一周没有性关系的女性的阴道冲洗液和20名健康男性的精液样本,将不同等分的精子与阴道冲洗混合以模拟真实情况,研究了流式细胞仪分离精子与阴道细胞的效果,分离后进行STR测序。因此,在强奸病例中,可以使用流式细胞仪从阴道清洗液中分离出精子细胞,进一步进行基因分型,确定出罪犯。
下图为Nunno等人的实验数据,C门就是精子,D门是阴道细胞:

                               
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玻璃体液与死亡时间
玻璃体液已被广泛用于估计PMI(死后时间间隔),因为它在解剖结构上被隔离的很好,因此自溶过程缓慢。 PMI估计的原理是用质谱检测玻璃体液中的钾浓度,然而玻璃体液取材过程容易受血液污染,从而影响结果。Corderio等人应用流式细胞仪检测玻璃体中的红细胞含量,可快速筛查出合格的样本,避免血液污染影响钾离子浓度检测,从而影响PMI的估计。
下图是他们的实验结果,从左到右是红细胞稀释比例越来越高,最右是无红细胞的散点图:

                               
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ABO血型
ABO血型系统不仅对输血和器官移植很重要,而且对于法医调查中的罪犯的鉴定也很重要。 用于ABO抗原检测的常规方法是血细胞凝集试验,但是该方法有一些局限性,就是无法量化红细胞(RBCs)上的ABO抗原。 Aki等人使用流式细胞仪和特定等位基因的PCR扩增(PASA)技术,通过添加二抗(荧光)定量分析ABO表型,同时进行血液和唾液样品的ABO基因分型。 他们发现流式细胞仪可以快速而有效地量化检测A、B和H抗原,确定好ABO血型后,再利用 PASA技术能进一步ABO基因多态性位点,能够完美的识别出罪犯。

展望
调查精度是法医学领域最重要的参数。因此,流式细胞术由于其高精度,在法医调查领域是非常有用的工具。
然而,到目前为止,流式相关的研究数量很少。此外,这些研究仅用流式细胞术分析了少量样品,并且地理区域小。其中大多数研究都超过了15年,这对于目前快速发展的流式来说太落后了。
脑组织和肝组织是PMI测定的最佳样品,但既往的研究对象太少,需要在不同条件下使用流式细胞术检测大量样本,建立可接受的DNA降解速率与PMI关系的曲线图,避免少量样本导致的误差。

参考文献:Bakdash A, Kumar S, Gautam KA, Mishra VC. Use of flow cytometry in forensic medicine: Current scenario and future prospects. J Forensic Leg Med. 2018 Oct 1;60:42-44. doi: 10.1016/j.jflm.2018.09.010.
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