手把手教你分析急性淋巴细胞白血病免疫分型

niwanmao

急性淋巴细胞白血病（ALL）是儿童最常见，而成人较少见的一种血液系统肿瘤，主要分为B和T两大类，分别占ALL的80～85％和15～20％。
形态学只能分出L1～L3，却无法区分B还是T，因此，流式细胞术免疫分型就显得至关重要。
有人说，用Ig链和T细胞受体（TCR）重排的分子研究也可以区分，实际上，IgH和TCR重排只支持克隆起源但不支持谱系特异性，因为TCR重排可以存在于大部分B谱系ALL中，反之亦然。
FCM诊断ALL应遵循三个具体步骤：

（1）区分B或T来源

（2）区分亚型
（3）与复发遗传异常相关的免疫表型的评估

但是，在上述步骤前，最基础的一步还是先在CD45/SSC图上圈出原始细胞。SSC很多地方喜欢用LIN，这没有问题，属于个人习惯问题，但这里演示的是SSC Log坐标，因为淋巴和单核、原始细胞在SSC Log上区分更清楚些。

第1步：CD45/SSC图上圈出原始细胞

先看正常骨髓的模板，分成以下区域，每个区域对应一类细胞，先彻底熟悉正常骨髓，方能找出异常：

熟悉好正常之后，我们在正常骨髓模板上叠加B-ALL细胞，可见大多B-ALL细胞出现在CD45偏弱、SSC中等的位置，在少数MLL＋的B-ALL则CD45偏强

至于T-ALL，大多数都是CD45偏强些的，所以比较靠近淋巴细胞位置

在开始后续的步骤之前，澄清一个观念：

很多地方，会喜欢用表达百分比来报告抗原表达率，但数字通常不能很好地说明存在异常细胞，因为它无法充分描述其免疫表型，同一个数字可能对应很多种表达形式，从而限制结果的解释。所以，应考虑半定量形式，将抗体荧光分布的定性描述为“阴性”，“阳性”，“部分表达”（相对于阴性对照群体），将抗体荧光强度为“dim”，“bright”，“heterogeneous或variant”，从而能够使医生或其它同行，即使不通过图形，也能充分了解抗原的表达情况。

第2步：B或T细胞来源的鉴定

CD7常在T-ALL中表达，具有高灵敏度，但在20％的急性髓性白血病中也可表达，因此特异性不够高。出于这个原因，需利用cyCD3的高灵敏性和高特异性，来确定T-ALL来源。
其它的T系抗原中，CD5也是个高灵敏性和特异性不错的选择，在大部分T-ALL中均表达，仅在10％的病例中（包括ETP-ALL）弱表达或阴性。
CD19的阳性足以覆盖几乎所有B细胞谱系的病例，无论CD19表达是低还是异质（例如BCR/ABL阳性ALL），但由于CD19在不少AML中也会出现伴随表达，所以B细胞系列来源必须通过cyCD79a、cyCD22和/或CD10的表达来进一步证实。

综上，可参考下表来确定ALL究竟是B或T细胞来源：

高度特异性	中度特异性	高度敏感性	中度敏感性	提示细胞群体
	CD7	CD7		T细胞
CD3(胞内/胞膜)		cyCD3		T细胞
CD5		CD5		T细胞
	CD19	CD19		B细胞
CD20			CD20	B细胞
	CD10	CD10		B细胞
cyCD22		cyCD22		B细胞
cyCD79a		cyCD79a		B细胞
cyIgM		cyIgM		Pre B细胞
IgM k或λ		IgM k或λ		成熟B细胞

第3步：区分ALL亚型

EGIL(European Group for the Immunological Characterization of Leukaemia)曾经出来下面这个表，区分对应B和T细胞不同发育阶段的亚型，尽管亚型的区分对于治疗和预后区别意义不太大，但有些地方还是比较倾向于此，因此仍附在这里。

B-ALL亚型区分：

T-ALL亚型区分：

在此，补充一种新亚型，ETP T-ALL，这个类型是由美国St Jude儿童研究医院和AIEOP-BFM小组的血液学家描述的一种新的具有预后相关性的T-ALL亚型，目前的标准是CD1a和CD8阴性，CD5通常呈阴性或弱阳性，但至少有下列抗原之一呈阳性：CD34、CD117、HLADR、CD13、CD33、CD11b和CD65，该亚型的预后还在研究中，可能跟治疗方案相关。

第4步：与复发遗传异常相关的免疫表型的评估

常见的复发遗传异常（即基因异常）相关的免疫表型，可参考下表进行评估判断：

	KMT2A/AF4	TEL/AML1	BCR/ABL	E2A/PBX1
CD45	pos/dim	pos/dim	neg/dim	pos/dim
CD19	pos	pos	常dim	pos
CD34	pos/neg	pos	pos/neg	neg
CD22	neg/dim	dim/pos	dim/pos	pos/dim
CD20	neg	neg	dim/pos	dim/pos
CD24	neg	pos	pos	pos
CD10	neg	bright	bright	pos/dim
cyIgM	neg	neg	neg	pos
CD15	常dim	neg	neg	neg
CD65	常dim	neg	neg	neg
CD13	大多neg	常pos	pos	neg
CD33	neg/dim	常pos	pos	neg
CD66c	neg	neg	pos	neg
CD9	pos	pos	pos	pos
NG2	pos	neg	neg	neg
CD25	neg	neg	pos	neg

第5步：出报告

流式报告，应该包含丰富而准确的免疫学信息，是医生正确评估血液疾病的重要组成部分。 AIEOP-BFM小组已经提出了FCM概要的标准化格式“Flow Diagnostics Essential (FDE) Code”，用于诊断白血病。 下面是几个示例报告样式，供参考：
（1）T-III T-ALL的报告（此处FDE指肿瘤细胞比例，i指的是胞内或核内，你也可以用cy或c。最后一行是诊断结论）：
FDE: 41%;
STRONG: CD1a,2,i3,4,7,8,45,iTdT;
NEGATIVE: CD3,10,13,14,15,19,22,33,34,i79a,iMPO,TCRab,TCRgd; T-ALL T-III
（2）伴CD33表达的Pre B-ALL报告，缩写含义同上：
FDE: 65%;
STRONG: CD10,19,22,33,34,i79a,HLA-DR,iTdT;
WEAK: CD20,45;
NEGATIVE: CD3,i3,7,8,13,65,kappa,lambda,iMPO;
NOT EVALUATED: iIgM;
pre B-ALL， B-II/III
（3）成熟B-ALL报告，缩写含义同上：
FDE: 30%;
STRONG: CD10,19,20,22,i79a,HLA-DR,IgM,kappa;
WEAK: CD38,45;
NEGATIVE: CD3,i3,7,8,iMPO,lambda;
Mature B-ALL B-IV。

完整的5步看下来，还有问题吗？可点击“阅读原文”到论坛讨论。

参考文献：
Kern, W., Béné, M., & Porwit, A. (2018). Multiparameter Flow Cytometry in the Diagnosis of Hematologic Malignancies (pp. 61-74). Cambridge: Cambridge University Press. Chapter 6: Acute Lymphoid Leukaemias (ALL) and Minimal Residual Disease in ALL

gamixi

太棒啦，好东西

simonli229

好文，谢谢分享

xuewa001

学习了，很棒的总结。