THP-1诱导的M2巨噬细胞分型

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大家好！我最近在做THP-1细胞经100ng/ml PMA和20ng/ml IL4/13诱导成M2巨噬细胞的实验，出现了很多问题，想请教一下！！！                                 大致的流式思路是：1. 先用7-AAD或者FVD450分析死活细胞 2.活细胞中分析CD11B/CD163/CD206的表达情况
请教一下：A. 1图中blank（M0和M2的混合细胞）为啥跑出来7-AAD是这幅模样？左下角那一小群细胞是什么？  B. 1图中M0和M2的7-AAD图为啥会出现右边两个小群细胞？活细胞怎么那么少？
C. 2图中用FVD450进行染色，阴性细胞群的位置为什么是在FSC/SSC的最左下角那一群？难道或者的细胞都是比较小，比较简单的细胞？
D. 3图中不考虑死活细胞情况下，没有粘连细胞，这样分析对不对？为啥主群细胞附近还有一小群细胞？
E. 4图中用细胞百分比及平均荧光强度分析，这样的结果可以么？感觉跟问下差异很大。
F. 这类实验具体的一个结果分析是怎么样的？要如何去分析结果？或者有什么其他好的建议？

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各位大神，帮忙分析分析，谢谢

niwanmao

图形成这样，应该与机器有关。可以先跑一下微球质控看看，如果没问题，说明机器本身显示就这样。左下角那群是指没在门内的那些？一般可认为是碎片，但建议加上CD45会更好确定性质。
我的建议你现在先用FVD和7-AAD阴性细胞分析

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niwanmao 发表于 2018-11-1 16:34
图形成这样，应该与机器有关。可以先跑一下微球质控看看，如果没问题，说明机器本身显示就这样。左下角那群 ...

倪老师，您好！谢谢您的回复！最近质控微球用完了，还没到货，所以这次实验是没有质控的，但是其他人也都用这机子跑，跑出来没有啥问题的，之前每次做试验前都有质控，也都是过关的。
左下角那一群细胞，就是没在圈门的细胞，我想问下，碎片不是直接用FSC/SSC就可以区分出来的么？我也有先用了FVD阴性的细胞进行分析了，结果跟这个差不多，CD206一直没有跑出来差异，也不知道是为什么？
另外，我圈住了1图中所谓的碎片，发现它的位置是在FSC/SSC图的最左下角那一群细胞，与FVD阴性群的细胞位置是一致的，这一点特别奇怪。
最后我还想问一下您，我这个分析思路是不是正确的？谢谢您了，做了好几次实验都出不来~

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这是图片

niwanmao

旅行到边际 发表于 2018-11-2 10:42
倪老师，您好！谢谢您的回复！最近质控微球用完了，还没到货，所以这次实验是没有质控的，但是其他人也都 ...

碎片染不上死活染料是对的。

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niwanmao 发表于 2018-11-5 08:12
碎片染不上死活染料是对的。

倪老师，那这次实验的死活细胞得如何分析？FVD450阴性是碎片么？那不是没有活细胞了？

niwanmao

旅行到边际 发表于 2018-11-5 08:29
倪老师，那这次实验的死活细胞得如何分析？FVD450阴性是碎片么？那不是没有活细胞了？ ...

FVD450和7-AAD阴性部分，再通过FSC/SSC排除碎片即可。

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niwanmao 发表于 2018-11-5 15:05
FVD450和7-AAD阴性部分，再通过FSC/SSC排除碎片即可。

那阴性细胞为啥感觉像碎片一样，结构很简单的。。。倪老师，我这实验思路有没有问题呢？后续如果要重新进行实验，下一步您有什么好的建议？

结气期

楼主，你好，我最近也在做这个THP-1诱导M2实验，用APC和PE-CYC5.5染色后出的图和你第三部分很像，我的目的是想分析M2细胞占的比例。不知道门怎么画，在这里想请教一下.