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[标本处理] 红细胞染色protocol

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发表于 2018-11-8 10:11:02 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
hi
各位老师,有没有做红细胞染色的方案啊,我在论坛里看了如何获取红细胞,但是我实验部分比较模糊,用抗体染色的时候还会出现细胞凝集成快,染色效果很差,怎么解决呢?

发表于 2018-11-9 07:43:41 | 显示全部楼层
染色时为什么会细胞凝集?没加抗凝剂?
 楼主| 发表于 2018-11-13 13:06:51 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-11-9 07:43
染色时为什么会细胞凝集?没加抗凝剂?

有抗凝剂,我取了5ul全血染色红细胞,但染完一抗后红细胞都聚集成小团快了。
发表于 2018-11-13 21:24:04 | 显示全部楼层
我想成大牛 发表于 2018-11-13 13:06
有抗凝剂,我取了5ul全血染色红细胞,但染完一抗后红细胞都聚集成小团快了。 ...

我平时也做PNH的红细胞染色,是将10ul抗凝全血加入到1mlPBS中,然后再取100ul。
 楼主| 发表于 2018-11-15 09:26:14 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-11-13 21:24
我平时也做PNH的红细胞染色,是将10ul抗凝全血加入到1mlPBS中,然后再取100ul。 ...

我做的是CD235a,昨天看了一些文献,他们是0.5ul血加入到50ul PBS里面,1500rpm 5min这样的洗涤条件。我试了一下,先按照条件将0.5ul的血分别加入到50ul的PBS和MACS里面,然后将0.5ug的间标抗体分别加进去,混匀后静置。结果15min后还是会出现聚集,移液器吹打都散不开,PBS和MACS没有明显的区别。
发表于 2018-11-16 08:23:42 | 显示全部楼层
我想成大牛 发表于 2018-11-15 09:26
我做的是CD235a,昨天看了一些文献,他们是0.5ul血加入到50ul PBS里面,1500rpm 5min这样的洗涤条件。我 ...

MACS不是磁珠分选吗?
有没有试过我前面说的方法,我们做PNH也是用CD235a标记红细胞的
 楼主| 发表于 2018-11-21 08:44:52 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-11-16 08:23
MACS不是磁珠分选吗?
有没有试过我前面说的方法,我们做PNH也是用CD235a标记红细胞的 ...

MACS是PBS+1%FBS+0.25mM EDTA。我按照老师的方法做了,我设了2组,一组同型对照,一组实验抗体,做了之后发现IgG1没有聚集沉淀,实验抗体聚集沉淀了。就是染色15min后,1500rpm离心之后,实验抗体的细胞聚集成小团快,并且枪吹不散。我还不清楚原因,可能需要查找一下影响因素。
发表于 2018-11-22 08:49:45 | 显示全部楼层
我想成大牛 发表于 2018-11-21 08:44
MACS是PBS+1%FBS+0.25mM EDTA。我按照老师的方法做了,我设了2组,一组同型对照,一组实验抗体,做了之后 ...

这有点奇怪的,我从来没见过这种事情,你用的CD235a是哪里的?克隆号是什么?什么荧光素标记?
 楼主| 发表于 2018-11-22 17:20:30 | 显示全部楼层
本帖最后由 我想成大牛 于 2018-11-22 17:21 编辑
niwanmao 发表于 2018-11-22 08:49
这有点奇怪的,我从来没见过这种事情,你用的CD235a是哪里的?克隆号是什么?什么荧光素标记? ...

CD235a有两个,一个时我们自己表达的,一个是BD的purified,克隆应该是GA-R2,两个的实验现象是一样的,都会聚沉红细胞。聚沉后我继续正常做,结果上机什么细胞都没有获取到。Mouse IgG1同型对照的现象是正常的,上机能获取到红细胞。
发表于 2018-11-25 18:58:08 | 显示全部楼层
我想成大牛 发表于 2018-11-22 17:20
CD235a有两个,一个时我们自己表达的,一个是BD的purified,克隆应该是GA-R2,两个的实验现象是一样的,都 ...

你的意思是这两个抗体都是没有荧光素的,那么实验用的是间标方法?实验温度是4度还是室温?
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