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楼主: 我想成大牛

[标本处理] 红细胞染色protocol

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 楼主| 发表于 2018-11-26 08:45:02 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-11-25 18:58
你的意思是这两个抗体都是没有荧光素的,那么实验用的是间标方法?实验温度是4度还是室温? ...

是间标抗体,我是在室温做的。。。有问题吗?
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发表于 2018-11-26 11:11:58 | 显示全部楼层
我想成大牛 发表于 2018-11-26 08:45
是间标抗体,我是在室温做的。。。有问题吗?

不知道做过多少个样本?如果每个都如此,实在说不过去,如果个别如此,我觉得可以在37度条件下试试看。
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 楼主| 发表于 2019-2-12 17:10:31 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2018-11-26 11:11
不知道做过多少个样本?如果每个都如此,实在说不过去,如果个别如此,我觉得可以在37度条件下试试看。 ...

由于PNH红细胞检测敏感度要求高,所以需要用CD235a(Glycophorin A)设门。首先,我们选择了可结合CD235a所有结构形式的克隆,因为一开始我们用了CD59 FITC检测目标抗原,所以CD235a选择了PE标记。然而,很不幸的是,CD235a PE会造成很明显的凝集,稀释也无法缓解这种现象,将CD235a改为FITC标记、CD59改为PE后,这种现象就消失了。
http://www.flowcyto.cn/bbs/forum ... 7&highlight=PNH

倪老师,这是站里的一篇帖子,我感觉找到了原因,我试过之后再来回复。
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发表于 2019-2-12 23:26:33 来自手机 | 显示全部楼层
我想成大牛 发表于 2019-2-12 17:10
由于PNH红细胞检测敏感度要求高,所以需要用CD235a(Glycophorin A)设门。首先,我们选择了可结合CD235a ...

这样的荧光素是会凝
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发表于 2021-10-28 17:00:22 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-2-12 23:26
这样的荧光素是会凝

是PE荧光素造成的凝集吗?最近在做红细胞流式(1)不加CD235a,只是加PE标记的二抗也会有聚集(2)APC-CD235a(克隆号HI264)好像也会有些凝集?
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发表于 2021-10-29 20:02:26 | 显示全部楼层
夏之韵 发表于 2021-10-28 17:00
是PE荧光素造成的凝集吗?最近在做红细胞流式(1)不加CD235a,只是加PE标记的二抗也会有聚集(2)APC-CD ...

摇床上摇着试试?
我好像都没碰到过你说的情形。
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发表于 2021-10-29 20:24:13 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-10-29 20:02
摇床上摇着试试?
我好像都没碰到过你说的情形。

重复了实验,大概能确认,1:100稀释的红细胞,一抗与红细胞表面抗原结合(生理盐水清洗前后均不聚集),加入IgG-PE二抗和APC-CD235a室温孵育30min(生理盐水清洗前后均能观察到聚集,可吹散,流式图见下)。如果只加入IgG-PE,不加APC-CD235a就不聚集。
所以推测是红细胞上结合比较大的荧光素分子造成的?考虑是不是换成AF系列的染料?
请倪老师指教,是哪里有问题,谢谢!
图片1.png
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发表于 2021-10-30 08:31:27 | 显示全部楼层
夏之韵 发表于 2021-10-29 20:24
重复了实验,大概能确认,1:100稀释的红细胞,一抗与红细胞表面抗原结合(生理盐水清洗前后均不聚集),加 ...

只加CD235a APC是否有聚集呢?
另外,上机前,静置的时间长吗?
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