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[流式相关软件] APC和PerCP荧光素荧光补偿补偿问题。

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发表于 7 天前 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
荧光素激发波长.png 这是eBioscience上各荧光素的激发波长,
1)我想请问,是不是只要存在PE和FITC这两种荧光溢漏都需要补偿?那是否APC和PerCP也需要补偿?理论上APC和PerCP属于不同激发光通道。
但是实际补偿的时候,上了一管PerCP单染管,会出现Q3的细胞上翘的情况。所以实际操作中都是需要将Q3和Q4这两群的细胞的Mean或Median值接近或一致吗?
2)还有请问第一个图中的荧光素组合合理吗?哪些荧光素之间需要补偿?
补偿问题.png


发表于 6 天前 | 显示全部楼层
PerCP与APC之间是否需要调节补偿,跟仪器的光路设计有关系的。
你这些荧光素中,FVD450基本独立,不用管。
FITC和PE
PE和PerCP 、PE-cy7之间。
APC和PE-cy7、PerCP可能有,看仪器。
发表于 6 天前 | 显示全部楼层
1)FITC和PE是488nm激光激发的,发射波长在滤光片上发生重叠,所以需要补偿。APC和PerCP属于不同激发光激发,理论上是"不同激光器激发的荧光不溢漏",但是我们在分析数据的时候确实也发现如Percp-cy5.5和APC之间确实有补偿,这是因为在记录Percp-cy5.5信号时Apc同时也被蓝激光激发了(虽然效率很低),也就有了我们分析数据时看到的“APC会漏到percp-cy5.5”。
实际补偿要求“横平竖直“,到不需要严格一致,越接近越好,有人用mean,也有人用median值,正态分布的数据应该问题都不大,我习惯用median值。

2)组合合不合理光染料,是看不出来的。要根据你研究的marker具体分析,您研究的关键标记尽量补偿较少,弱marker搭配亮染料,共表达要注意荧光溢漏等等的。这些配色原则论坛里面都有。多色补偿直接自动补偿就好了。

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 楼主| 发表于 5 天前 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-1-10 09:11
PerCP与APC之间是否需要调节补偿,跟仪器的光路设计有关系的。
你这些荧光素中,FVD450基本独立,不用管。
...

谢谢倪老师,我使用的仪器型号是BD FACS Canto。1)使用PerCP单染管进行手动补偿的时候,会出现第二个那种细胞上翘的情况,那是不是就说明该光路设计的话并不满足“不同激发光的通道之间理论不用补偿”,那实际应用中是不是也得调整Q3和Q4这两群细胞的Median值一样?

2)还有上空白细胞管调补偿的时候,各个通道的PMT电压值为多少合适?默认的500,上空白细胞管的时候,直方图显示各个荧光通道细峰形的位置都在10的2次方的左边,那是不是意味着这些荧光通道的电压可以不用调整,按默认的就可以?
 楼主| 发表于 5 天前 | 显示全部楼层
sunny2829 发表于 2019-1-10 09:19
1)FITC和PE是488nm激光激发的,发射波长在滤光片上发生重叠,所以需要补偿。APC和PerCP属于不同激发光激发 ...

谢谢解答。
1)那按照图1那种组合情况,PE-cy7的发射波长与FITC,PE,PerCP和APC通道存在重叠,那是不是意味着PE-cy7的荧光都会溢漏到FITC,PE,PerCP和APC通道,理论是都得在这四个通道进行补偿对吧?
2)我使用的仪器是BD FACS Canto,上PerCP单染管的时候,APC那里会出现细胞上翘,那说明是存在荧光溢漏的。那按发射波长存在重叠的话,APC理论上也是需要跟PE,PerCP和PE-CY7进行补偿?
发表于 4 天前 | 显示全部楼层
marvelwong 发表于 2019-1-11 14:29
谢谢倪老师,我使用的仪器型号是BD FACS Canto。1)使用PerCP单染管进行手动补偿的时候,会出现第二个那 ...

1、要调。
2、用空白管调电压。最佳电压确定是需要技巧的,站内搜索“电压”可知,但一般实验中暂不需要。
发表于 前天 09:33 | 显示全部楼层
marvelwong 发表于 2019-1-11 14:36
谢谢解答。
1)那按照图1那种组合情况,PE-cy7的发射波长与FITC,PE,PerCP和APC通道存在重叠,那是不是 ...

PE-Cy7和PE ,PerCP是有补偿的。PE-Cy7和FITC补偿较低。
PE-Cy7也会被633nm激光,但是PE-Cy7发射波长在APC660/20滤光片范围内荧光很低,补偿值0.01,0.02这么低的话,有时候可以忽略,影响不大。所以如倪老师所说,看仪器。

上PerCP单染管的时候,APC那里会出现细胞上翘,那说明是存在荧光溢漏的。那就APC%减去PerCP%即可。实际上机,就看实际溢漏情况,有荧光溢漏,就调整即可。


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