APC和PerCP荧光素荧光补偿补偿问题。

marvelwong

这是eBioscience上各荧光素的激发波长，
1）我想请问，是不是只要存在PE和FITC这两种荧光溢漏都需要补偿？那是否APC和PerCP也需要补偿？理论上APC和PerCP属于不同激发光通道。
但是实际补偿的时候，上了一管PerCP单染管，会出现Q3的细胞上翘的情况。所以实际操作中都是需要将Q3和Q4这两群的细胞的Mean或Median值接近或一致吗？
2）还有请问第一个图中的荧光素组合合理吗？哪些荧光素之间需要补偿？

niwanmao

PerCP与APC之间是否需要调节补偿，跟仪器的光路设计有关系的。
你这些荧光素中，FVD450基本独立，不用管。
FITC和PE
PE和PerCP 、PE-cy7之间。
APC和PE-cy7、PerCP可能有，看仪器。

sunny2829

1)FITC和PE是488nm激光激发的，发射波长在滤光片上发生重叠，所以需要补偿。APC和PerCP属于不同激发光激发，理论上是"不同激光器激发的荧光不溢漏"，但是我们在分析数据的时候确实也发现如Percp-cy5.5和APC之间确实有补偿，这是因为在记录Percp-cy5.5信号时Apc同时也被蓝激光激发了（虽然效率很低），也就有了我们分析数据时看到的“APC会漏到percp-cy5.5”。
实际补偿要求“横平竖直“，到不需要严格一致，越接近越好，有人用mean，也有人用median值，正态分布的数据应该问题都不大，我习惯用median值。

2）组合合不合理光染料，是看不出来的。要根据你研究的marker具体分析，您研究的关键标记尽量补偿较少，弱marker搭配亮染料，共表达要注意荧光溢漏等等的。这些配色原则论坛里面都有。多色补偿直接自动补偿就好了。

marvelwong

niwanmao 发表于 2019-1-10 09:11
PerCP与APC之间是否需要调节补偿，跟仪器的光路设计有关系的。
你这些荧光素中，FVD450基本独立，不用管。
...

谢谢倪老师，我使用的仪器型号是BD FACS Canto。1）使用PerCP单染管进行手动补偿的时候，会出现第二个那种细胞上翘的情况，那是不是就说明该光路设计的话并不满足“不同激发光的通道之间理论不用补偿”，那实际应用中是不是也得调整Q3和Q4这两群细胞的Median值一样？

2）还有上空白细胞管调补偿的时候，各个通道的PMT电压值为多少合适？默认的500，上空白细胞管的时候，直方图显示各个荧光通道细峰形的位置都在10的2次方的左边，那是不是意味着这些荧光通道的电压可以不用调整，按默认的就可以？

marvelwong

sunny2829 发表于 2019-1-10 09:19
1)FITC和PE是488nm激光激发的，发射波长在滤光片上发生重叠，所以需要补偿。APC和PerCP属于不同激发光激发 ...

谢谢解答。
1）那按照图1那种组合情况，PE-cy7的发射波长与FITC，PE，PerCP和APC通道存在重叠，那是不是意味着PE-cy7的荧光都会溢漏到FITC，PE，PerCP和APC通道，理论是都得在这四个通道进行补偿对吧？
2）我使用的仪器是BD FACS Canto，上PerCP单染管的时候，APC那里会出现细胞上翘，那说明是存在荧光溢漏的。那按发射波长存在重叠的话，APC理论上也是需要跟PE，PerCP和PE-CY7进行补偿？

niwanmao

marvelwong 发表于 2019-1-11 14:29
谢谢倪老师，我使用的仪器型号是BD FACS Canto。1）使用PerCP单染管进行手动补偿的时候，会出现第二个那 ...

1、要调。
2、用空白管调电压。最佳电压确定是需要技巧的，站内搜索“电压”可知，但一般实验中暂不需要。

sunny2829

marvelwong 发表于 2019-1-11 14:36
谢谢解答。
1）那按照图1那种组合情况，PE-cy7的发射波长与FITC，PE，PerCP和APC通道存在重叠，那是不是 ...

PE-Cy7和PE ，PerCP是有补偿的。PE-Cy7和FITC补偿较低。
PE-Cy7也会被633nm激光，但是PE-Cy7发射波长在APC660/20滤光片范围内荧光很低，补偿值0.01，0.02这么低的话，有时候可以忽略，影响不大。所以如倪老师所说，看仪器。

上PerCP单染管的时候，APC那里会出现细胞上翘，那说明是存在荧光溢漏的。那就APC%减去PerCP%即可。实际上机，就看实际溢漏情况，有荧光溢漏，就调整即可。

pahlloidin

niwanmao 发表于 2019-1-10 09:11
PerCP与APC之间是否需要调节补偿，跟仪器的光路设计有关系的。
你这些荧光素中，FVD450基本独立，不用管。
...

倪老师，请问BV650和APC可以搭配使用吗，我们的机器是BD fortessa，biolegend技术支持说可以，但是两个波长这么接近，补偿不会很大吗？谢谢

niwanmao

pahlloidin 发表于 2019-3-13 09:44
倪老师，请问BV650和APC可以搭配使用吗，我们的机器是BD fortessa，biolegend技术支持说可以，但是两个波 ...

激发光不一样的，可以用的。

wmj123456

niwanmao 发表于 2019-3-13 14:14
激发光不一样的，可以用的。

倪老师，关于APC和bV605能否一起搭配的问题，您说激发光不一样，但是可以用。我理解的是，他俩激发光不一样，理论上没有什么补偿的，但是实际上他俩的发射光谱是有些重叠的，但是不是重叠很大，应该能调的开，所以您说可以用么？是我理解的这个意思吗？