FITC/PI检测凋亡求助

小丸子-维维豆奶

试剂盒是凯基生物的，实验步骤大概如下：

1、用PBS洗细胞2次。

2、 用无EDTA的胰蛋白酶消化细胞。

3、用适量的培养基终止消化，将细胞悬液转移至离心管中，

4、 1,000 rpm离心5 min，弃上清。

5、 加入PBS后1,000 rpm离心/10 min，弃上清。重复本步操作一遍。

6、我只做了2组，对照组和染毒组，处理好细胞后，每组细胞加入 Binding Buffer 400ul，

7、 将对照组取100 ul步骤6中的细胞悬液，加入到新的tube中，共4组，分别作为空白对照、单染FITC、单染PI、双染；染毒组分为4支tube，双染

9. 加染液：

对照组：  空白对照：不加

      单染FITC：只加5 uFITC

单染PI：只加5 uPI、

双染：加入5 ul FITC混匀，再加入5 ul的PI

染毒组： 加入5 ul FITC混匀，再加入5 ul的PI

10、室温避光15分钟后，每只tube中加入适量Binding Buffer补足500ui

11、上流式细胞仪检测

检测：用空白对照调电压，单染FITC和单染PI组调补偿。

请问这个实验过程有问题吗？

结果：对照组

file:///C:\Users\ADMINI~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps8BCB.tmp.pngfile:///C:\Users\ADMINI~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps8BCC.tmp.png

染毒组

file:///C:\Users\ADMINI~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps8BCD.tmp.png

file:///C:\Users\ADMINI~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps8BCE.tmp.png

麻烦老师帮忙看一下结果，另外，之前没用过流式细胞仪，想请问有没有详细的流式细胞仪操作的教程？对调补偿和设十字门很疑惑

Wlmedicine

图3的凋亡图形OK，实验过程没什么问题，标记抗体完成后一个小时内检测。补偿精髓是横平竖直。画门一是根据细胞群的位置，二是根据文献。

小丸子-维维豆奶

Wlmedicine 发表于 2019-1-15 15:40
图3的凋亡图形OK，实验过程没什么问题，标记抗体完成后一个小时内检测。补偿精髓是横平竖直。画门一是根据 ...

所以实验过程是没有问题的吧？第一次做的时候FITC没有染上，技术说可能是试剂盒失效了，给换了一个试剂盒，然后用新的试剂盒做了一次，两组的Q4都不是很多，所以不太确定是不是fitc染色出了问题

Wlmedicine

可以用凋亡诱导剂处理过的细胞做阳性对照或者换试剂

小丸子-维维豆奶

Wlmedicine 发表于 2019-1-15 20:52
可以用凋亡诱导剂处理过的细胞做阳性对照或者换试剂

请问我实验组中Q2中的细胞特别多，可能是什么原因导致的呢

Wlmedicine

Q4认为细胞处于凋亡状态，Q2细胞死亡。说明细胞死的多。

范晋波

Wlmedicine 发表于 2019-1-16 21:47
Q4认为细胞处于凋亡状态，Q2细胞死亡。说明细胞死的多。

Q4是早凋吧，Q2是晚凋，Q1死亡吧

范晋波

小丸子-维维豆奶 发表于 2019-1-15 18:16
所以实验过程是没有问题的吧？第一次做的时候FITC没有染上，技术说可能是试剂盒失效了，给换了一个试剂盒 ...

没有做AV的单染试一下么？

家的感觉

很明显凋亡的结果图里面没有设置，导致你的结果其实看的是包括碎片在内的所有颗粒的凋亡情况。设门里面的show populations显示成P1，再看结果。