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OMIP-047:B细胞表型多维流式分析

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发表于 2019-3-12 23:14:06 | 显示全部楼层 |阅读模式

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免疫系统中,大家特别关注的都是T细胞及其亚群,但是往往忽略了体液免疫重要成员——B细胞及其亚群、功能。
慢性病毒性疾病如HIV-1和丙型肝炎病毒感染,可导致B细胞亚群的剧烈变化,最明显的变化就是B细胞向成熟和耗竭表型转化、未成熟CD10+过渡B细胞比例增高。因此,HIV-1感染中的B细胞功能往往是受损的,导致机体对各种感染因子和疫苗的体液反应延迟和不足。
因此,有必要深入分析患者B细胞亚群及其功能的变化。
《OMIP-047: High-Dimensional phenotypic characterization of B cells》[1]一文,给我们带来了一个16色方案,简洁明了。



方案
方案里面,CD3、CD14、CD16作为排除性抗体,排除掉T、单核、粒、NK等细胞干扰;CD19作为B细胞设门抗体;CD10、IgD、CD38区分B细胞亚群;CD21分出功能亚群和区分耗竭状态;CD27区分记忆状态;IgG1、IgG3、IgA分出三种类型转换B细胞;CCR7、CXCR3、CXCR4、CXCR5检测B细胞迁移能力;IL-21R检测B细胞表面细胞因子IL-21受体;Ki67检测B细胞增殖能力。
2019031301.png


分析和设门
首先,依然是常规的Time参数图圈液流稳定区域、FSC/SSC排除碎片、FSC-A/FSC-H排除粘连体,接着利用CD3/CD14/CD16和CD19,选出CD3/CD14/CD16均阴性而CD19+的B细胞,紧接着,将B细胞分为CD10+和CD10-两类:
2019031302.png

CD10+ B细胞可根据CD38/IgD分出CD38+IgD+的过渡B细胞,这个门是根据FMO对照来设的(左侧为FMO对照,右侧为实验管):
2019031303.png

CD10- B细胞组成较为复杂,由CD38-IgD+未转换B细胞、CD38-IgD-记忆B、CD38 high IgD-浆母细胞组成,未转换B细胞又可进一步通过CD27分为CD27+的边缘区B细胞、CD27-的初始B细胞:
2019031304.png

前图中CD38-IgD-的记忆B,通过CD21/CD27进一步分为CD27+CD21-活化记忆B(AM)、CD21-CD27-组织样记忆B(TLM)、CD21+CD27+静止记忆B、CD21+CD27-中间记忆B(IM),可见HIV+患者AM和TLM部分显著增多:
2019031305.png

如果根据B细胞表面的Ig受体,又可分为IgG1+记忆B、IgG3+记忆B、IgA+记忆B、non-IgA/IgG1/IgG3 记忆B四类:
2019031306.png

为了明确B细胞的迁移能力,用CCR7、CXCR3、CXCR4、CXCR5来评估,此外,用IL-21R评估B细胞对IL-21的反应能力,该因子对于B细胞产生高亲和力抗体必需的,如下图,利用FMO对照设门,B细胞的趋化因子和IL-21R表达非常明显:
2019031307.png

下面这张图是为了告诉我们,并不是每个抗体都需要用FMO,这个问题在论坛上不少站友都问过。这张图中的CD27和CCR7,从密度上很明显可以看出分群,因此不需要用FMO对照:
2019031308.png


在健康人样本中,由于CXCR3+和Ki67+B细胞比例很低,因此需要FMO对照来精确设门:
2019031309.png

OK,如此下来,对B细胞的设门和分群一目了然了吧。即使你的仪器没有16个通道,也可以试着分成多管搭配分析了!

References
[1] 《OMIP-047: High-Dimensional phenotypic characterization of B cells》: https://doi.org/10.1002/cyto.a.23488

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