使用小鼠MEF细胞做细胞周期问题咨询

库库哈

想请教下关于做细胞周期的问题，我们使用的是小鼠MEF细胞，用的是DAPI染色（由于后续实验需要只能使用DAPI染色），实验步骤见下方。同时我们也做了PI染色进行对比。现在发现的问题是加大激光强度，看不到明显的峰，然后最后得到的周期的图也很难看。不知道是染色的问题，还是仪器操作的问题，我们用的仪器是BD FACSAria II特殊定制型，跑CST的话是发现蓝色激光CV值有点大。
希望得到解答，谢谢了。

DAPI 染色

PI染色

Cell Cycle Staining Protocol-DAPI
1. Harvest cells- wash 2X in PBS to get rid of serum proteins. 1200rpm, 5 min
2. Resuspend pellet (up to 3x106 cells) in 1.2 ml PBS (Ca and Mg free).
3. Add 3.0 ml ice cold 95% EtOH dropwise while vortexing. This crosslinks proteins.
4. Fix in this final 70% EtoH solution for at least 30 min
5. Decant, and wash again in 15mL PBS; continue spinning at 2000-2200 rpm for 10 min.
6. Count cells
7. Resuspend in 1.5-2.0ml DAPI stain solution (final concentration of 1x106 cells/ml) and incubate for 30 min at 4degrees or on ice.
DAPI Stain Solution 0.1%TritonX 100 in 10ml PBS add 100ul of 1mg/ml DAPI to the 10ml TritonX solution

livan724

很多细胞没染上啊，是不是固定出了问题

库库哈

固定是很容易出问题，DAPI我们用的是sigma D9542，应该没有问题，在荧光显微镜下看，基本上都染上了。但是流式上就不行了。不知道是什么原因。

库库哈

livan724 发表于 2019-3-14 15:47
很多细胞没染上啊，是不是固定出了问题

固定是很容易出问题，DAPI我们用的是sigma D9542，应该没有问题，在荧光显微镜下看，基本上都染上了。但是流式上就不行了。不知道是什么原因。

niwanmao

1、注意一下激发波长和滤光片设置是否和DAPI的光谱匹配（激发358nm，发射461nm）。
2、第3步的95％乙醇这步去掉，直接第4步加入70％乙醇，固定2小时以上。
其它照旧。
再试试。