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[细胞周期] 关于细胞周期中M期阻滞细胞的筛选--流式上机前的染色问题

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发表于 2019-3-14 16:05:20 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
最近课题做了一个小分子化合物,基本可以使悬浮的肿瘤细胞抑制在G2/M期,于是我想再进一步检测一下细胞是具体抑制在G2期还是M期的。查阅了文献以后,查到一篇文章:Loss of KLF14 triggers centrosome amplification and tumorigenesis Fan, G.; Sun, L.; Shan, P. (...)  Nature Communications, 2015, 6(1) ,里面可以用光辉霉素染M期细胞的,具体图是这样的,上面的染色步骤是这样的For analysis with mithramycin staining, an aliquot of 26106 cells was incubated with 2 ml of 0.1% nonidet P-40 in PBS for 5 min, followed by fixation with the addition of 0.7 ml of 4% formaldehyde in PBS and gentle shaking of the cells at 4℃ for 15 min. DNA was stained with 20 mg/ml mithramycin A。可以我按照上面操作以后,发现,细胞只要一加入0.1%的NP40中,就成团,变得很黏,不管怎么弹都没用~~~~~~而且是一加进去就成这样,后面试了各种方法,包括将NP40浓度降到0.01%,减少破膜时间等等,都不行,崩溃,求高人指点。

预期的实验图,M期阻滞细胞

预期的实验图,M期阻滞细胞
 楼主| 发表于 2019-3-14 16:17:27 | 显示全部楼层
群里可有做过M期细胞阻滞的大神吗?或者是其他的染色固定的方法?求推荐求推荐,不要沉啊~~~
发表于 2019-3-15 08:52:44 | 显示全部楼层
NP40我们以前用于提取蛋白的,这个实验的目的是想把细胞破掉,提出细胞核,染Mithramycin。

看来是存在困难,而且mithramycin这个方法时间比较久了。
我觉得简单点的话,可以用7-AAD和anti-Ki67双染(参见http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2809-1-1.html
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