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[流式protocol] OMIP-048:质谱流式定量淋巴细胞亚群中的钙传感器和通道

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发表于 2019-3-25 23:17:33 | 显示全部楼层 |阅读模式

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Ca2+信号传导对于T细胞亚群功能的激活和调节至关重要。在T细胞受体结合后,磷脂酶Cγ活化通过IP3受体的开放诱导来自内质网(ER)储存的Ca2 +释放,从而导致质膜中Ca2 +释放活化的Ca2 +通道(CRAC)的活化。就这样,这种被称为store-operated Ca2+ entry(SOCE)的Ca2+流入诱导生理反应(例如T细胞活化和分化)所需的细胞内Ca2+浓度的变化。有多种离子通道、传感器和信号分子参与Ca2+浓度的波动,在这些蛋白质中,stromal interaction molecules(STIM)1和2可感应内质网存储的Ca2+耗竭,而ORAI蛋白(ORAI1及其两种同种型,ORAI2和3)是CRAC通道的成孔亚基。 Ca2+ 浓度波动也受到线粒体摄取Ca2 +的调节,这一过程可调节线粒体ATP合成和能量状态、细胞代谢和存活,主要受电压依赖性阴离子选择性通道(VDAC)蛋白的调节,这些蛋白存在于线粒体外膜中。在所描述的三种VDAC同种型中,VDAC1是主要的Ca2 +通道,并且转录最多。最后,T细胞活化时局部Ca2+变化被钙离子信号分子(Ca2+和钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶钙调神经磷酸酶,简称CN)检测到。 CN负责活化T细胞(NFAT)去磷酸化的核因子及其核转位。
据报道,Th1、Th2和Th17亚群对Ca2 +对刺激的反应不同,这是T细胞亚群中Ca2 +离子通道和传感器的各种表达模式的可能结果,但这些通道和传感器在蛋白质水平上仍然很难被检测。为此,Jaracz-Ros A等人在《OMIP-048 MC: Quantification of calcium sensors and channels expression in lymphocyte subsets by mass cytometry.》一文中采用质谱流式,在原代小鼠淋巴细胞的单细胞水平进行了此类分析,值得做细胞功能研究的FLOWER参考。

方案
2019032601.png
这里用的都是重金属,如果希望改为常规流式,可考虑相同克隆号,然后搭配成多管检测,还是可行的。


设门分析
首先依然是常规的选择有核细胞、排除粘连、选活细胞、选择CD45+白细胞。在这里,不得不插一句,质谱流式的图形真没常规流式好看^_^
2019032602.png

接着,选择CD3+B220-,排除掉B细胞,再通过CD5+CD3+,进一步圈定T细胞:
2019032603.png

继续对T细胞进行CD4、CD8分群,这里只分成CD4+T和CD8+T两群,接着再从CD4+T中根据foxP3表达分出Treg和CD4+常规T细胞:
2019032604.png

常规CD4+T、Treg、常规CD8+T三群细胞,根据CD44/CD62L,分成CD62L+CD44-初始T、CD62L-CD44+Tem、CD62L+CD44+Tcm三个阶段:
2019032605.png

常规CD4+T、Treg、常规CD8+T三群细胞的f Ki-67、CD5、STIM1/2、ORAI1/2/3、VDAC1的表达,黑色、红色、蓝色曲线依次对应初始T、效应记忆T、中央记忆T三个阶段,光看这几个图形,大家可能一下子看不出非常明显的趋势:
2019032606.png

改成看下面8只小鼠3次独立实验后的统计结果(Mean±SEM),可见荧光强度之间的显著变化:
2019032607.png

可见这些钙离子通道和感应蛋白在T细胞活化过程中基本上均出现明显的增高。
感兴趣的FLOWER可尝试着用常规流式来做做看?

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