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[流式protocol] OMIP-051:B细胞、DC、单核细胞亚群和功能分析的28色方案

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发表于 2019-5-8 13:06:10 | 显示全部楼层 |阅读模式

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这是NIH NIAID的Mario Roederer他们在2019年2月份Cytometry杂志上发表的一个Panel,《OMIP-051 - 28-color flow cytometry panel to
characterize B cells and myeloid cells》
。这个方案是一项大型免疫研究的一小部分,主要是为了分析B细胞、树突细胞和单核细胞亚群组成、活化和抑制功能分子表达情况。具体哪些指标,咱们边走边看,并且详细解读每个指标的含义,以及为什么设计进去。
方案
先看方案,该方案是28色,但是我们大多数人做不到这么多色,可以根据表中标准的用途,把各系的设门抗体拆分出来,然后再跟自己需要做的功能分子逐一组合成10色以内的方案:
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设门和依据
1、排除粘连体、去碎片、去死细胞:
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2、通过CD14/SSC圈CD14+的单核细胞,B细胞和树突细胞表达高水平的MHC II类但缺乏CD14,因此,设门圈选MHC II类分子、CD20任何一个分子的CD14-细胞,用于随后的B细胞和树突细胞分析。
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3、B细胞是接受刺激后分泌抗体的重要免疫效应细胞,这些抗体分子在消除病原体方面起着至关重要的作用,迄今为止大多数疫苗都是基于保护性抗体反应的引发。 B细胞可以通过它们的CD19和CD20表达按下图设门:
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但是,可在CD19+CD20+/-B细胞内鉴定出不寻常的SSC-Ahigh/FSC-Ahigh细胞,这些细胞显示出与单核细胞相似的FSC-A/SSC-A特征,因此,在B细胞设门后再加一个淋巴细胞门,可排除这些细胞干扰:
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4、未成熟的过渡性B细胞在骨髓中分化出来,然后进入外周血后进一步成熟为未接触抗原的初始B细胞。CD10已被证明可用于区分过渡性B细胞(CD10 +)和成熟B细胞(CD10-)。
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5、B细胞在活化后,可分化为短期存活浆母细胞(short-lived plasmablasts),分泌第一波低亲和力抗体,或参与生发中心(GC)反应,在生发中心,可选择出高亲和力B细胞克隆,并且免疫球蛋白可从IgD/IgM到IgA、IgG或IgE同种型类别转换。这些IgA、IgG或IgE同种型的特征在于诱导抗体介导的效应功能更强。在GC反应期间的选择中,B细胞可以发育成长期存活记忆B细胞,具有引发快速继发免疫反应的能力,长期存活浆细胞会迁移到骨髓或变成分泌大量抗体的短期存活浆母细胞。
在本方案中,前述CD10-成熟B细胞基于CD27和IgD表达分为三个亚群:即初始B细胞(IgD + CD27-)、包含浆母细胞(CD27highCD20low)和记忆B细胞(CD20 + CD27 +/-)的IgD-B细胞、IgD + CD27 + B细胞,而IgD + CD27 + B细胞能进一步分为IgM +边缘区(MZ)B细胞和IgD-only记忆B细胞。 边缘区B细胞占外周人B细胞的20%,能产生大量聚糖定向抗体,而这些抗体对于清除细菌感染至关重要。
浆母细胞很少见,但在稳态下可检测到,在接种疫苗后或感染期间更容易检测到,由于经过生发中心的选择,记忆B细胞可表达不同的B细胞受体同种型,因此,本方案中包括了IgA、IgG和IgM。
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6、B细胞稳态受细胞因子的影响。 APRIL和BAFF是TNF家族的成员,是B细胞存活和分化的重要调节因子,这两种受体的突变或完全缺乏与自身免疫和免疫缺陷有关。APRIL和BAFF可以与受体BCMA和TACI结合,但只有BAFF能够与BAFF受体(BAFF-R)相互作用。 这些受体在B细胞亚群中表达不同。 然而,这些受体的组合表达模式如何影响对BAFF和APRIL的反应尚不清楚。
本方案中包含了对TACI和BAFF-R表达的分析。虽然BAFF-R在除浆母细胞外的所有成熟B细胞亚群中高表达,但TACI表达在幼稚B细胞中较低,在B细胞后期(如记忆B细胞)上调。
BCMA主要表达在浆母和浆细胞中,由于健康成人这些细胞比例少,所以没有放在本方案中。
调节GC反应的关键细胞因子之一是IL-21,它可以促进生发中心的选择、B细胞亲和力成熟、B细胞存活和浆细胞分化。因此,本方案中也加入了IL-21R的表达检测,这可以研究稳态或疾病期间B细胞亚群对IL-21的反应性。
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7、趋化因子受体影响免疫细胞的转运和定位。 为此,方案中加入了趋化因子CXCR3和CXCR5。当干扰素γ刺激的单核细胞和成纤维细胞分泌CXCL9-11时,表达CXCR3的细胞会被吸引到炎症组织中。 相比之下,与CXCR5相互作用的CXCL13主要由生发中心的滤泡树突细胞产生,所以主要是将B细胞吸引到生发中心进行免疫监测和参与GC反应。
此外,方案中还包括了两种免疫调节分子CD23和CD73。 CD23是一种低亲和力IgE受体,可调节和抵消BCR介导的B细胞活化。相反,CD73是参与将促炎性三磷酸腺苷(ATP)水解成免疫抑制性腺苷的胞外酶,可产生免疫抑制环境。有趣的是,腺苷不仅与免疫抑制有关,而且可以在类别转换重组中发挥关键作用。我们将CD73放在B515通道,因为它在方案中具有较低的优先级,而我们的目的是跟踪抗原特异性B细胞。不过B515通道渗漏扩散误差小,因此,对于仅在稀有群体(例如抗原特异性B细胞)上弱表达的标记而言,这个通道是很好的选择。此外,在B515通道中商品化Brilliant Blue 515荧光染料是迄今为止最亮的,能确保最佳分辨率。
树突细胞的关键作用之一是抗原呈递和刺激T细胞。 刺激的T细胞上调CD154,CD154是与抗原呈递细胞和B细胞上的CD40相互作用的重要共刺激分子。 CD40:CD154相互作用导致细胞活化,是B细胞活化的重要共刺激信号。 因此,方案中还包括CD40。
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8、B细胞衰竭可在慢性刺激时发生,其特征在于补体受体2(CD21)的下调以及抑制性受体CD85j水平的增加。 此外,这些细胞的特征在于多种分子的表达谱的改变,例如趋化因子和细胞因子受体以及共刺激分子,如下图的TACI、CD27和CXCR5。
有趣的是,CD21lowCD85j high的B细胞表现出转录因子T-bet的表达增加,而表达T-bet的B细胞与抗病毒反应以及自身免疫疾病的发病有关。
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9、树突细胞表达高水平的HLA-DR,并进一步分为CD123 + CD11c-浆细胞样DC(pDC)或CD123-CD11c +髓样树突细胞。 浆细胞样树突状细胞的特征是在TLR-7和-9刺激上分泌高水平的干扰素α,是抵抗病毒感染的重要先天防御体系。 相反,骨髓树突细胞(mDC)的特征在于能够将抗原呈递给T细胞并诱导T细胞活化。
基于CD1c和CD141,区分了几个mDC亚群:
CD141 + CD1c-mDC(CD141 + mDC)
CD141-CD1c + mDC(CD1c + mDC)
CD141-CD1c-双阴性(DN)mDC(DN mDC)
已知CD141 + DC可交叉递呈MHC I上的肽分子,因此具有启动CD8 + T细胞应答的能力,而另外两个DC群体,即CD1c + DC和DN DC,被称为经典的树突细胞,是通过MHC II途径递呈肽的。
CD14lowCD16 +的单核细胞,能分泌高水平的促炎细胞因子如IL-1β,通过高维单细胞分析和单细胞RNA测序技术,人们研究了单核细胞和树突状细胞之间的关系,发现这些细胞之间的区别变得不像以前预期的那样明显,特别是,CD14lowCD16 +单核细胞亚群的转录谱,与树突细胞更相似。因此,我们将单核细胞定义为CD14高表达的细胞,而CD14lowCD16 +的细胞则定义为缺乏CD1c和CD141的特殊mDC群体(DN mDC)
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10、B细胞,树突细胞和单核细胞表达多种Fc受体,这增加了捕获和吞噬抗原的能力。 此外,Fc受体是细胞活化的重要调节剂。 因此,方案中包括了三种不同的IgG Fc受体:CD16、CD32和CD64。
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