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[结构和原理] CD45-PerPC-Cy5.5试剂测试全血,出现强荧光SSC弱的散点图数据?

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发表于 2019-5-22 15:25:53 | 显示全部楼层 |阅读模式
2流星
本帖最后由 zhangjuanLAY 于 2019-5-22 15:38 编辑

用自己标记的CD45-PerPC-Cy5.5在BD C6上检测全血,散点图数据为什么会出现大量SSC信号弱但应该很强的数据?
细胞碎片出现强荧光标记

购买的BD试剂盒

购买的BD试剂盒

自己标记的抗体试剂

自己标记的抗体试剂
发表于 2019-5-22 17:59:41 | 显示全部楼层
这看上去更像是样本处理问题似的。是不是裂解液问题?
 楼主| 发表于 2019-5-23 12:06:43 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-5-22 17:59
这看上去更像是样本处理问题似的。是不是裂解液问题?

倪老师,我用的是同样的溶血剂处理的全血,做了两次都是这样的结果,BD的试剂没有出现这种现象。
发表于 2019-5-24 15:25:23 | 显示全部楼层
自己标记的流式抗体?会不会是荧光直接与细胞结合了呢?
发表于 2019-5-26 19:56:33 | 显示全部楼层
zhangjuanLAY 发表于 2019-5-23 12:06
倪老师,我用的是同样的溶血剂处理的全血,做了两次都是这样的结果,BD的试剂没有出现这种现象。 ...

挺难找原因的,如果多次重复均如何,就感觉是不是你的抗体导致了大多数细胞碎掉了,只标记了少数细胞?
 楼主| 发表于 2019-6-3 14:56:46 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-5-26 19:56
挺难找原因的,如果多次重复均如何,就感觉是不是你的抗体导致了大多数细胞碎掉了,只标记了少数细胞? ...

多次重复都是这样的
如果考虑是抗体的原因,那我试试直接加抗体与血液样本孵育再上机测试
 楼主| 发表于 2019-6-6 09:38:35 | 显示全部楼层
本帖最后由 zhangjuanLAY 于 2019-6-6 09:41 编辑
niwanmao 发表于 2019-5-26 19:56
挺难找原因的,如果多次重复均如何,就感觉是不是你的抗体导致了大多数细胞碎掉了,只标记了少数细胞? ...

尝试直接用PerCP-Cy5.5串联染料标记细胞,荧光信号比自制CD45-PerCP-Cy5.5的还要强,但是也没有出现散射信号弱,荧光信号强的细胞群。单独用CD45标记细胞,与空白没有太大区别。
另外自己标记的抗体上机检测时阴性和阳性细胞根本分不开。


PerCP-Cy5.5.jpg
自制试剂.jpg
BD.jpg
CD45直接与细胞作用.jpg
空白.jpg
发表于 2019-6-6 10:37:23 | 显示全部楼层
zhangjuanLAY 发表于 2019-6-6 09:38
尝试直接用PerCP-Cy5.5串联染料标记细胞,荧光信号比自制CD45-PerCP-Cy5.5的还要强,但是也没有出现散射信 ...

会不会是你的标记过程中对Percp-CY5.5有影响,使cy5.5脱落,导致第一次的图中的信号完全是Percp的信号?另外,最后标记完成后是否置换保存buffer,buffer的条件是否对细胞有影响?最后一个猜测,是不是自制试剂处理的样品上机时细胞及碎片太多,导致SSC信号降低?

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 楼主| 发表于 2019-6-6 12:19:34 | 显示全部楼层
我想成大牛 发表于 2019-6-6 10:37
会不会是你的标记过程中对Percp-CY5.5有影响,使cy5.5脱落,导致第一次的图中的信号完全是Percp的信号?另 ...

我也觉得是串联染料降解导致的,不过没想到怎么解决这个问题。我买了商品化的PerCP-Cy5.5试剂盒进行标记,是没有问题的。
保存缓冲液是:PBS-EDTA
有什么可以改善的建议吗?
发表于 2019-6-7 08:26:49 | 显示全部楼层
zhangjuanLAY 发表于 2019-6-6 12:19
我也觉得是串联染料降解导致的,不过没想到怎么解决这个问题。我买了商品化的PerCP-Cy5.5试剂盒进行标记 ...

即使荧光标不上,也不应该SSC也不出来啊,这是我疑惑的地方。因为粒细胞SSC很大的,你看都缩在SSC压缩的区域,这是不正常的。
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