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质谱流式和光谱流式的科普和优缺点介绍,你支持哪个?

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发表于 2019-7-5 11:08:44 | 显示全部楼层 |阅读模式
流式细胞仪仍然是无与伦比的单细胞分析技术,分析数百万甚至更多细胞上的多个荧光参数的能力,使得流式能够帮助人类深入理解复杂的生物过程。
然而,常规流式在发展过程中,渐渐表现出一些缺陷,主要表现为荧光染料的限制,即使方案经过精心设计,也无法避免光谱渗漏、自发荧光等问题,使用的荧光染料的数量越多,这些问题就越大。


质谱流式
为了克服这个问题,先是出现了质谱流式。
质谱流式的基础原理是飞行时间质谱(TOF-MS),TOF-MS是一种非常精确和稳健的方法,用于测量离子的质荷比。在TOF分析中,所有离子通过已知强度的电场加速,并且测量这些离子在已知距离上到达检测器所花费的时间。 离子越重,到达探测器所需的时间越长。

在质谱流式中,选择的标记是高度纯化的稳定同位素。

为了进行质谱流式检测,需要将同位素引入TOF并且避免细胞污染仪器,这就需要将细胞气化,仅留下同位素,为此,在进行TOF之前,需先将引入电感耦合等离子体(ICP)使细胞气化,将剩余的金属离子引入TOF检测。

所以,通过稳定同位素抗体的标记,经过ICP的细胞气化,最后通过TOF-MS检测离子,三者合一,就是质谱流式。原理绘制成一张图就是下面这样:
20190705_091613.png

质谱流式的优点:
>可以使用传统的标记技术,在方法学上改变很小
>在质谱细胞计数中没有“自发荧光”,因为细胞内部不含镧系元素离子
>无“补偿” 或补偿非常微小
>方案设计更容易

但任何事物都有局限性,质谱流式的缺点:
>与传统的流式细胞仪相比,采集速度更慢,每秒一般最多约1000个事件
>样品制备必须比传统流式更干净,因此在获取时所有生物材料都会气化,如果不干净可能导致碳积聚并降低灵敏度
>商业标记抗体数量有限(不过目前越来越多厂家加入,使得这些目录逐渐在完善)
>复杂的数据结构,需要新的数据分析工具和方法
>由于细胞被气化,所以没法进行FSC和SSC测量


光谱流式
光谱流式是从另一条路解决荧光补偿问题,就是光谱解析,解析原理见下图,需要事先学习荧光素的光谱特征,不同荧光素都有其独特的光谱特征,有点像人脸识别似的,只不过比人脸识别简单多了。通过这种解析,就智能得消除了常规流式累死人的荧光渗漏影响:
20190705_092750.png

但实际上在硬件上,光谱流式同时还大大降低了光路的复杂程度,使得仪器成本能够大大降低。常规流式要做到12色,可能需要12~14个独立检测器和40多个滤光片,而光谱流式,不仅避免了这种复杂架构,而且实现同等参数检测的仪器成本只有常规流式的五分之一。
20190705_093430.png
光谱流式最开始是Purdue大学2004年ISAC会议上提出的,2007年10月9日获得专利US7280204(http://www.cyto.purdue.edu/sites ... 4-issued-patent.pdf),专利后来授权给了索尼,Purdue大学该页面(http://www.cyto.purdue.edu/Spectral%20Flow%20Cytometry)还有几个蛮有意思的声明,在此不方便直接翻译,不知道是否有知情人能解答一下?

对于光谱流式,同样也有优点和缺点。
优点是:
>与常规流式在方法学一致,可直接拿来就用,过渡性好
>能通过特异性光谱特征,方便地去除“自发荧光”信号
>即使以前发射波长相近的荧光素,例如GFP和FITC,由于波形不一样,在光谱流式上也能解析开
>方案设计更容易

缺点是:
目前在公开资料中未看到对光谱流式的缺点介绍,但事物都有两面性,我个人虽然未用过光谱流式,但从光谱流式公司公开资料上的光谱流式与常规流式数据对比上看,可以看出在信号强度上,部分荧光素的强度整体是要弱于常规流式的,这可能对于某些微弱信号会有点麻烦,当然,这纯属个人猜测,请用过光谱流式的FLOWER能够出来确认一下。


质谱流式vs光谱流式,你更好看哪项技术?
在本帖底部投个票,通过上面的简单介绍,你觉得质谱流式和光谱流式,哪项技术更有前途?


参考文献:
Introducing CyTOF: Cytometry of the Masses. https://bitesizebio.com/20066/in ... etry-of-the-masses/
John P. Nolan and Danilo Condello. Spectral Flow Cytometry. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3556726/
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/cyto.a.23779
J. Paul Robinson. Spectral flow cytometry—Quo vadimus?http://www.cyto.purdue.edu/Spectral%20Flow%20Cytometry



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