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[细胞因子检测] 胞内细胞因子关键问题请教

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发表于 2019-7-17 18:01:34 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
各位老师:
       我最近在做胞内细胞因子检测,用20AA的多肽刺激鸡脾脏淋巴细胞,发现阳性率很低,以下是我的大概流程
用病毒感染鸡两次后分离脾脏淋巴细胞,然后用之前ELISPOT鉴定的肽去刺激淋巴细胞,用12孔板培养,每个孔加入350万细胞,阳性对照加入ConA,浓度为10ug/ml,肽段浓度为20ug/ml,刺激2h后加入BD公司的BFA(按1:1000),继续孵育5h,然后收集细胞到EP管进行流式染色。使用BD公司的Fixation/Permeabilization Solution Kit with BD GolgiPlug™进行固定和破膜。由于目前市面上没有直接标记的anti-chicken IFN-y荧光抗体,所有胞内抗体我选用了anti-chicken IFN-y Biotin为一抗,室温孵育1h后加入二抗eBioscience™ Streptavidin FITC ,4度孵育30min,染色后进行流式分析。结果发现阳性细胞很少,我使用一抗的浓度为0.2ug/ml.想请教一下各位老师,针对这个结果我应该从哪些方面进行优化?是否有必要延长孵育时间到16h,是否可以通过加大抗体浓度?谢谢!

微信图片_20190717180042.png
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发表于 2019-7-18 09:17:10 | 显示全部楼层
你将一抗浓度提高到1~5ug/ml试试,做个梯度。
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 楼主| 发表于 2019-7-18 10:51:04 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-7-18 09:17
你将一抗浓度提高到1~5ug/ml试试,做个梯度。

老师您好!您觉得我做胞内染色刺激时间延长到16h是不是效果更好?还有BD公司的那个BFA阻断12h影响大吗?
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发表于 2019-7-19 10:44:57 | 显示全部楼层
行棋无悔 发表于 2019-7-18 10:51
老师您好!您觉得我做胞内染色刺激时间延长到16h是不是效果更好?还有BD公司的那个BFA阻断12h影响大吗? ...

延长感觉不是有必要呀。免疫细胞反应的时间12小时内应该是能完成的。
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