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[结构和原理] 一个单染(相当于)遇到的分群没有的困惑

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发表于 2019-9-4 20:08:44 | 显示全部楼层 |阅读模式
5流星
实验设计是这样的:两盘吞噬细胞,一个连接了荧光的微球(只有细胞吞进去后才会显gfp颜色,没有吞进去就不会显色的),一盘不加,24h培养后,用荧光显微镜看没有任何问题,如图1所示,当然不会每个细胞都吞,大概也就5%的比例,然后我想用流式去统计下吞进去的比例,其实相当于个单染而已,图2是不加微球的对照,图3是加了荧光微球的(补偿先不说),可是为什么没有清楚的两群呢,我把它们的FL1(GFP通道)柱状图叠加在一起(图4:这个图4不对劲啊),按理说应该像图5(这是别人文章中发的图,也是同样的实验)一样,加了荧光微球的分明显两群才对,大家可以帮我解答这个问题吗?谢谢大家啦,不甚感激。

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 楼主| 发表于 2019-9-4 20:10:42 | 显示全部楼层
图片的编号对应上传后备注的图片序号,而不是.jpg前面的数字。
 楼主| 发表于 2019-9-4 20:16:22 | 显示全部楼层
图片顺序是倒着的,最后一张是图1,然后倒着看
发表于 2019-9-5 08:40:25 | 显示全部楼层
从图中看,细胞吞了微球,但没发出光。
所以,我个人觉得需要从你的微球上找原因
 楼主| 发表于 2019-9-5 10:17:33 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-9-5 08:40
从图中看,细胞吞了微球,但没发出光。
所以,我个人觉得需要从你的微球上找原因 ...

倪老师,图1是我准备跑流式上机前,从流式细胞管里面吸了20ul,滴了一个波片拿到荧光显微镜下看的,所以吞后发光这个是没有问题的应该,正常的结果就如别人文章里的那个图5,是阴性(没吞的)和一小群阳性(吞了的)两群才对,从我的结果上看,也就是图3,还是一群,虽然与空白对照(不加微球的那一群)明显的右偏了一些(柱状图),但是还是一群啊,当然我自己分析原因时,有一点就是发现细胞不管吞没吞,只要加了微球后,细胞的背景都会变绿,所以造成的分群不开。
发表于 2019-9-8 23:07:01 | 显示全部楼层
潘潘杰 发表于 2019-9-5 10:17
倪老师,图1是我准备跑流式上机前,从流式细胞管里面吸了20ul,滴了一个波片拿到荧光显微镜下看的,所以 ...

是不是吞完之后,你没有进行PBS洗涤?
 楼主| 发表于 2019-9-9 09:11:21 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-9-8 23:07
是不是吞完之后,你没有进行PBS洗涤?

洗过了,倪老师,用pbs洗过四遍,最后悬浮上机,而且其实它不吞进去,是不会有颜色的,也不会造成背景干扰,这种荧光染料是一种ph显色的,后来几天又重复了几次实验,还是没法解决这个问题。question: 1: 加了吞噬小球的这些细胞,fsc和ssc的第一个门,细胞的分布会和blank组不一样,ssc变大,说明吞了后细胞变大了。 2: 这个帖子只是我的第一个实验,后续的实验,是看一个基因是否对细胞的吞噬有影响。实验设计很简单:是在这个细胞里过表达一个基因,所以转入载体的时候,载体上连接了一个红色荧光(PE),细胞亮了说明过表达进去了,我最后统计红色细胞里有多少个绿色小球亮了就好,但是更棘手的问题是,不管是荧光显微镜还是流式细胞仪,fitc和pe交叉太大了,所以我用荧光显微镜看,用488激发,fitc通道看,一片绿,球也是绿的,细胞也是绿的,488激发,cy3通道看,一片红。根本无法区别开来,然后将细胞吹打下来跑FACS,补偿都没法调,就如这个帖子一样,就是单一的一群,根本分不开。
发表于 2019-9-9 09:18:53 | 显示全部楼层
潘潘杰 发表于 2019-9-9 09:11
洗过了,倪老师,用pbs洗过四遍,最后悬浮上机,而且其实它不吞进去,是不会有颜色的,也不会造成背景干 ...

如果真像你上面那幅图像所示,不应该在流式上分不开啊。你在用的具体是什么型号的流式细胞仪?
 楼主| 发表于 2019-9-9 10:34:34 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-9-9 09:18
如果真像你上面那幅图像所示,不应该在流式上分不开啊。你在用的具体是什么型号的流式细胞仪? ...

贝克曼FC500
 楼主| 发表于 2019-9-9 10:36:56 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2019-9-9 09:18
如果真像你上面那幅图像所示,不应该在流式上分不开啊。你在用的具体是什么型号的流式细胞仪? ...

fc500确实不怎么好用啊,3通道是各种串色,而且倪老师,你看帖子中的3图,那个柱状图也好散点图也好,属于单一的一群吗?还是连续性表达的两群?
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