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[磁珠分选] 磁珠分选小鼠脾脏CD8+细胞纯度上不去

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发表于 2019-10-1 07:06:53 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏50流星未解决
用美天旎anti-APC 磁珠和MS小柱子分选小鼠脾脏细胞,步骤和结果如附图,抗体和磁珠有试过完全按照说明书推荐的等比例添加,结果与下图实验结果基本一致,分选纯度也只有50~60%。 过一遍柱子纯度只有50%~60%,过两遍柱子才能到80%   但是这个纯度还是不够啊,分选之后培养至少要90%的纯度,跪求大神指点,按道理脾脏细胞很干净不需要过两次柱子。


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分选结果

分选结果
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发表于 2019-10-1 09:47:53 | 显示全部楼层
正选一般要过3次柱子吧
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 楼主| 发表于 2019-10-1 10:24:11 | 显示全部楼层
liuruiluna 发表于 2019-10-1 09:47
正选一般要过3次柱子吧

您好,您是说阳选细胞您一般过三次柱子?  会影响细胞活性继而影响后续培养吗?
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发表于 2019-10-1 17:47:19 | 显示全部楼层
本帖最后由 liuruiluna 于 2019-10-1 18:04 编辑

影响培养的因素很多,多过一遍柱子不至于影响多少,但是科学意义上说,当然分选时间越短,对活性保护越好,磁珠分选是这样的,纳米级磁珠很小,多过一遍纯度会提高,相应的回收率会降低,纯度与回收率两者就是这样的一个关系。你要看你的需求,如果纯度达不到你的需求,那就通过多过一遍柱子提高纯度,牺牲一些回收率和一点点细胞活性,看什么对你最重要。 有时候流式分选为了达到最大纯度还做二次分选嘞,那个对活性的影响更大。看自己实验的主要矛盾和次要矛盾。 另外,你那个流式图,不应该把debris圈进去,那些不是细胞,记录在纯度分析里没有意义。主要看分出来的细胞的纯度。你重新圈一下,可能纯度已经达到90%以上了

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发表于 2019-11-1 16:17:18 | 显示全部楼层
看你的废液里CD8 T细胞几乎没有,说明磁珠标记CD8 T细胞的效率还是比较好的,只不过在过柱时有大量的CD8- 细胞滞留在柱上了,没有冲下来。就我个人的经验,在磁珠标记细胞结束,上柱分选前用40 μm的细胞滤器过滤细胞,减少各种原因导致的细胞粘连,避免其堵塞分选柱,导致大量的未被磁珠标记的细胞被堵在了柱上,降低分选的纯度。另外,我不太认同你“用500 μl buffer润洗分选柱,待液面流完时立即加样品”的做法,你可以尝试在柱上留至少一半体积的buffer,然后把细胞加到buffer中,降低进入分选柱的细胞悬液的浓度,防止短时间内过多细胞进入柱体,导致分选柱堵塞;你也可以把细胞悬液进行一定比例的稀释后分多次上柱。

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