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[图片] 流式可以测的最常见转录因子列表及其所表达的细胞

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发表于 2019-10-22 10:07:42 | 显示全部楼层 |阅读模式

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细胞功能和分化都受调节基因表达的细胞内转录因子的控制。由于这些因素通常是蛋白质,因此可以使用针对蛋白质中某些特定表位的抗体进行检测。
因此,转录因子的检测本质上是与检测细胞表面的蛋白质没有什么不同。然而,由于目的蛋白将位于细胞内、胞浆中、细胞器中或细胞核中,因此细胞必须破膜以允许抗体能够到达其结合位点。由于需要在采样时让转录因子保持在其亚细胞位置和生理状态,因此需要采样后立即进行固定。

因此,通过流式细胞仪检测转录因子需要仔细计划,并注意几个特定问题,这些问题将决定应遵循的最佳方案。这些问题中最重要的是:“是否需要表面染色(即表型分析)来鉴定目标细胞?”

这个问题的答案至关重要,因为它将决定制备细胞的最佳方法,从而使抗原能够进入细胞内区室及其靶标。 这也将影响所用荧光染料的选择,因为不同的固定方法可能会对荧光分子产生巨大影响。 两种最常见的固定剂是醇和醛,每种都有其优缺点。
醇类(例如乙醇、甲醇或丙酮)是一种脱水固定剂,既可以凝结蛋白质(固定),又可以在脂质膜上形成孔(通透性)。 醇类固定后很容易检测到许多细胞周期蛋白和磷酸化特异性蛋白。 不幸的是,醇类固定会对诸如GFP的荧光蛋白产生不利影响,而这种荧光蛋白会受到醇类固定的影响,从而在构象改变后不再发出荧光,甚至可能从细胞中漏出。
醇类固色也会影响常用的荧光染料,包括PE、PerCP和APC,使得这些荧光染料不能作为检测转录因子时表面染色选择。 而诸如FITC、AlexaFluor和花青染料之类的小环氟化合物对醇固定的抵抗力更高。
醛类的话,通常用1-4%的甲醛进行醛固定。醛类是交联固定剂,通过在赖氨酸残基之间形成交联键,从而形成亚甲基桥,从而将蛋白质结构锁定在适当的位置。这通常意味着抗体仍会识别其表位。但是,甲醛本身并不是一种很好的破膜剂,通常会与去污剂结合使用,这是市场上许多Fix和Perm试剂盒的基础(尽管商业试剂盒的确切成分是由于知识产权政策而未知)。可以使用一系列去污剂,例如Triton X-100、溶血卵磷脂、Nonidet-P40和皂苷。选择可能取决于蛋白质的定位,如转录因子位于核内的,通常需使用更强的去污剂如Triton X-100(通常约为0.1%)是一个不错的选择,因为它可以破胞膜和核膜。另一方面,由于皂苷的“温和”和可逆性,故无法破入核膜,仅经常在细胞因子染色中应用。

下表概括了流式细胞术可以检测的常见转录因子种类、表达的细胞、胞内的定位,凡是表中的转录因子,大家都可以放弃Western,改做流式,实现更精细的结果,了解在不同亚群中的改变。
转录因子.png
数据来源:Eur. J. Immunol. 2017. 47: 1584–1797





发表于 5 天前 | 显示全部楼层
倪老师、在高尔基体表达的转录因子在标记时是否需要阻断?
 楼主| 发表于 5 天前 | 显示全部楼层
苏沁沁 发表于 2019-11-13 09:09
倪老师、在高尔基体表达的转录因子在标记时是否需要阻断?

还是阻断一下吧。
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