请教大家一些流式微藻细胞计数和染色的问题,设备是BD Accuri C6 Plus
1、阈值的设定为什么会影响藻细胞的计数?不进行任何染色处理,根据藻细胞的自发荧光来表征,是通过PerCP通道的藻红蛋白荧光信号峰来圈门的。FSC/SSC取的是对数,因为用线性分得不是很开,经对数变换后,藻细胞群的横坐标(FSC-H)大约在10E+06,当阈值(FSC-H)设定为2000时,藻细胞数量为30000个/8μL;当设定为200时,藻细胞数量为30000个/25μL,只不过是调低了阈值,藻细胞浓度显著下降了?查阅说明书后发现仪器要求每秒的事件数需要控制在10000以内,最好是2500个以内以提高分辨率,回看自己的数据,阈值为200时可以飙到20000+Events/Sec,此时就算是只跑纯净水也有很多杂质,2000也有将近16000~17000+Events/Sec,所以是因为超过了仪器的检测限而导致测出来的藻细胞数目不一致吗?
2、如果用SYBR Green I 染色还需不需要遵循上述原则即选定一个合理阈值使颗粒数保持在10000甚至是2500以内?