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标题: 流式抗体设计 [打印本页]

作者: willow2013 时间: 2013-3-6 09:13
标题: 流式抗体设计
各位老师好，我要检测间充质干细胞，用BD的流式细胞仪，选择了分别由FITC，PE和APC标记的抗体，文献说三种不同荧光标记的抗体可以放在一只管内检测，可以节省细胞，我想问一下，1、这三种荧光直标的抗体如何设计具体实验？如空白对照？同型对照？荧光补偿？2、如果三种抗体都加到一个管中，需要的细胞量是多少？3、直标抗体如何分装？能否冻存？谢谢

作者: niwanmao 时间: 2013-3-6 10:49
1、用空白管调节电压，然后用FITC单标管，调节FL2-FL1的补偿，用PE单标管，调节FL1-FL2补偿，调节补偿的时候，可以同时适当调节电压。
2、三种抗体同时加到一管，细胞量跟标准需求一样，即1×10E6，也可以低于这个数。
3、直标抗体跟间标抗体一样，不能冻存，保存在4度冰箱。不需要分装，一般效期都还可以的。

作者: willow2013 时间: 2013-3-6 10:59

niwanmao 发表于 2013-3-6 10:49

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1、用空白管调节电压，然后用FITC单标管，调节FL2-FL1的补偿，用PE单标管，调节FL1-FL2补偿，调节补偿的时 ...

谢谢倪老师！
我买的抗体有的是100tests的，看有人说要分装，还在想几百微升要怎么分呢

作者: niwanmao 时间: 2013-3-6 11:01

willow2013 发表于 2013-3-6 10:59

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谢谢倪老师！
我买的抗体有的是100tests的，看有人说要分装，还在想几百微升要怎么分呢 ...

一般大公司的抗体包装瓶上都会写有效期至××××年××月的。

作者: willow2013 时间: 2013-3-6 11:05
那这三种抗体加的时候有先后顺序吗？

作者: niwanmao 时间: 2013-3-6 11:16

willow2013 发表于 2013-3-6 11:05

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那这三种抗体加的时候有先后顺序吗？

多数情况下，先后顺序没关系，但对于一些结合位点有冲突的，可能就有影响，但很少：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2117-1-1.html

实验都是需要探索条件的，你说是吧

作者: willow2013 时间: 2013-3-6 11:25

niwanmao 发表于 2013-3-6 11:16

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多数情况下，先后顺序没关系，但对于一些结合位点有冲突的，可能就有影响，但很少：http://www.flowcyto. ...

恩，是的，

作者: willow2013 时间: 2013-3-6 12:39
如果要用同型对照的话，有三种荧光标记的同型对照，直接放到一管内检测就可以了吗？

作者: niwanmao 时间: 2013-3-6 12:45

willow2013 发表于 2013-3-6 12:39

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如果要用同型对照的话，有三种荧光标记的同型对照，直接放到一管内检测就可以了吗？ ...

空白管、FITC单标管、PE单标管，这三管就可以了，同型对照加到上述三管中（当然，后两管中相应荧光的同型不要加），也是可以不用加同型对照的。

作者: willow2013 时间: 2013-3-6 13:37

niwanmao 发表于 2013-3-6 12:45

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空白管、FITC单标管、PE单标管，这三管就可以了，同型对照加到上述三管中（当然，后两管中相应荧光的同型 ...

倪老师您上次说过，同型对照也可以用，只是效果不如FCM对照好！如果有同型对照的话，就是三种不同荧光的同型对照一只管，三种荧光标记的抗体一只管，再加一个空白管就可以了吗？

作者: niwanmao 时间: 2013-3-6 14:12

willow2013 发表于 2013-3-6 13:37

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倪老师您上次说过，同型对照也可以用，只是效果不如FCM对照好！如果有同型对照的话，就是三种不同荧光的 ...

不是的，呵呵，你还没有理解我刚才的意思。
共三管：
第一管  空白，或者三个同型对照，用来调节电压
第二管  FITC＋其它两个非FL1通道的同型（或者同型不加也可以），调节FL2-FL1补偿
第三管  PE＋其它两个非FL2通道的同型（或者同型不加也可以），调节FL1-FL2补偿
2、3两管其实相当于FMO对照了。
由于APC跟其它两种颜色之间没有补偿，所以不需要另设FMO管

作者: willow2013 时间: 2013-3-6 14:27

niwanmao 发表于 2013-3-6 14:12

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不是的，呵呵，你还没有理解我刚才的意思。
共三管：
第一管空白，或者三个同型对照，用来调节电压

哦，呵呵！是这样。
我买了A-FITC，B-PE，C-APC，D-FITC，E-PE，及F-PE这些抗体，本来是想A-FITC，B-PE，C-APC一个管检测，D-FITC，E-PE一个管检测，F-PE再一个管检测，外加FITC、PE和APC同型对照一个管检测的，因为老板要我们按照他给的文献来，我看文章里的描述大体就是这样，不知道这样是不是可行

作者: niwanmao 时间: 2013-3-6 14:35

willow2013 发表于 2013-3-6 14:27

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哦，呵呵！是这样。
我买了A-FITC，B-PE，C-APC，D-FITC，E-PE，及F-PE这些抗体，本来是想A-FITC，B-PE， ...

你检测的抗体怎么组合无所谓，我上面说的这三管是用来调节电压和补偿的，必须要这么做。至于用来调节的FITC和PE标记的抗体，尽可能选择高表达的。

作者: willow2013 时间: 2013-3-6 14:38

niwanmao 发表于 2013-3-6 14:35

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你检测的抗体怎么组合无所谓，我上面说的这三管是用来调节电压和补偿的，必须要这么做。至于用来调节的FI ...

哦，知道了，谢谢您

作者: 刘星宇 时间: 2013-3-6 23:02

niwanmao 发表于 2013-3-6 10:49

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1、用空白管调节电压，然后用FITC单标管，调节FL2-FL1的补偿，用PE单标管，调节FL1-FL2补偿，调节补偿的时 ...

倪老师好，我觉得科研实验的抗体还是分装一下好吧，200μl/管，因为我觉得不同于临床的试剂常用，用得快，而且老师的技术成熟。对于我们新手用，分装后可以避免造成污染。个人愚见。

作者: niwanmao 时间: 2013-3-6 23:05

刘星宇发表于 2013-3-6 23:02

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倪老师好，我觉得科研实验的抗体还是分装一下好吧，200μl/管，因为我觉得不同于临床的试剂常用，用得快 ...

现在其实有小包装的吧，25test，或者50test的。

作者: 刘星宇 时间: 2013-3-6 23:10

niwanmao 发表于 2013-3-6 23:05

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现在其实有小包装的吧，25test，或者50test的。

很多都是100t，如果抗体减半可以做到200t，小包装太少，几个小包装加起来价格比大包装的贵。

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