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标题: 理解流式数据中的MFI [打印本页]

作者: niwanmao 时间: 2013-6-4 16:24
标题: 理解流式数据中的MFI
流式细胞仪的技术在不断进步，其获取速度、灵敏度、应用范围在不断扩大，往往一个标本可以获取成千上万个数据点，如何找到最好的方法来比较这些数据，是流式分析中的重点。在流式分析中最易被误解或误用的工具就是MFI。

什么是MFI？
MFI（平均荧光强度），是算术平均数、几何平均数、中位荧光强度的统称。在理想情况下，数据应该是正态分布，平均数（means）、中位数（median）、众数（mode）三个值是相等的。但实际情况下，流式数据几乎都不是正态分布的，数据倾斜得越大，平均值就越向倾斜方向漂移。
众数（Mode）统计学名词，是一组数据中出现次数最多的数值，有时众数在一组数中有好几个。
因为荧光强度通常用LOG模式获取，故算术平均数此时无法统计此类数据，就需要改用几何平均数（gMFI）。但值得一提的是，gMFI对于log正态分布的数据代表性非常好，但对于倾斜同样非常敏感（大家可以用实际数据试试）。因此，对于非正态的数据，只剩下中位数可用了，中位数受数据的倾斜、极端值等影响很小。所以在目前情况下，一般来说，中位数是最安全的MFI指标。

图：MFI三种类型在正态分布和非正态分布情况下的位置
[attach]3387[/attach]

MFI使用时常见的三个错误：
1、用MFI来描述一个双峰分布的细胞群体：一个双峰细胞群，并非正态，而且具有两个类似正态的群体，故MFI不适合。此时，选择阳性峰进行阳性百分比分析更有统计意义。
2、比较不同实验中的MFI：因为MFI对实验条件很敏感（如抗体稀释度、串联染料的降解、激光的波动等），所以比较不同次实验中间的MFI是非常危险而且不正确的做法。
3、盲目使用MFI作为表达的定量指标：流式可以对抗原的表达进行定量，但需要依赖于对标准曲线的校准和滴定。而且，并不是说某细胞群MFI高，其表达量就高，MFI低，其表达量就低，还需要考虑细胞大小、补偿等因素。

那么，我们如何正确使用MFI呢？
MFI有一些重要的用途，但很多情况下，它非但没有对我们的数据起到证明作用，反而起到干扰作用。故建议只有当你认为MFI是你证明实验结果最好的比较方法，并且MFI使用时没有发生上述错误时，才使用它。

进一步阅读参考文献：
Nature Immunology的一篇评论 Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed
http://facs.scripps.edu/ni0706-681.pdf

作者: 刘星宇 时间: 2013-6-4 18:49
请教倪老师，“因此，对于非正态的数据，只剩下中位数可用了，中位数受数据的倾斜、极端值等影响很小。所以在目前情况下，一般来说，中位数是最安全的MFI指标。”
不管是否正态分布，均可以使用median值？而且比Geo-mean值好？

作者: niwanmao 时间: 2013-6-4 19:45

刘星宇发表于 2013-6-4 18:49

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请教倪老师，“因此，对于非正态的数据，只剩下中位数可用了，中位数受数据的倾斜、极端值等影响很小。所以 ...

倾斜很厉害的数据，可能median能更好反映其荧光改变。
但是就象最后那段所说，如果百分比数据能够反映你的结果，还是尽可能别用MFI。

作者: 刘星宇 时间: 2013-6-4 21:46

niwanmao 发表于 2013-6-4 19:45

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倾斜很厉害的数据，可能median能更好反映其荧光改变。
但是就象最后那段所说，如果百分比数据能够反映你的 ...

都是弱表达的抗原，不到10%，通过直方图看到右移。

作者: niwanmao 时间: 2013-6-4 22:19

刘星宇发表于 2013-6-4 21:46

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都是弱表达的抗原，不到10%，通过直方图看到右移。

哦。那可以试试MFI

倾斜厉害吗？如果类似于正态分布，可以用geomean，如果一侧斜的比较厉害，可以看看median

作者: samly0 时间: 2013-6-5 10:47
太感谢了，我之前一直误以为某细胞群MFI高，其表达量就高，MFI低，其表达量就低，没考虑过细胞大小、补偿等因素的影响。学习了

作者: 20071271 时间: 2013-6-5 10:55
提MFI，发现试验组比对照组还低，这是什么情况，不能用

作者: niwanmao 时间: 2013-6-5 11:55

20071271 发表于 2013-6-5 10:55

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提MFI，发现试验组比对照组还低，这是什么情况，不能用

你所说的对照是同型对照还是阴性对照？

作者: 刘星宇 时间: 2013-6-5 21:01

20071271 发表于 2013-6-5 10:55

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提MFI，发现试验组比对照组还低，这是什么情况，不能用

是否是同型对照的背景过高了？没有用无荧光抗体拮抗掉非特异性受体？或者洗涤不够？我之前的也是检测管减掉同型对照的MFI得出负数值，敷上抗体后充分洗涤了，再相减就是正值了。

作者: haven_t 时间: 2013-6-5 21:22

刘星宇发表于 2013-6-5 21:01

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是否是同型对照的背景过高了？没有用无荧光抗体拮抗掉非特异性受体？或者洗涤不够？我之前的也是检测管减 ...

减法是不行的，应该用除法。

作者: niwanmao 时间: 2013-6-5 22:54

刘星宇发表于 2013-6-5 21:01

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是否是同型对照的背景过高了？没有用无荧光抗体拮抗掉非特异性受体？或者洗涤不够？我之前的也是检测管减 ...

原因说的没错，只是不建议用减的方式来计算结果。

作者: 20071271 时间: 2013-6-6 09:47

niwanmao 发表于 2013-6-5 11:55

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你所说的对照是同型对照还是阴性对照？

阴性对照

作者: niwanmao 时间: 2013-6-6 10:02

20071271 发表于 2013-6-6 09:47

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阴性对照

同型对照出现这类情况比较多，原因多数就是象@刘星宇所说的那样。
阴性对照如果出现这类情况，如果确认染色步骤均一致，就需要注意细胞的状态。

作者: 刘星宇 时间: 2013-6-6 21:04
本帖最后由刘星宇于 2013-6-6 21:07 编辑

haven_t 发表于 2013-6-5 21:22

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减法是不行的，应该用除法。

原来是这样。曾在AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE 文献看到：“Inset: Numbers indicate the median ﬂuorescence intensity (MFI) minus the MFI of the isotype control.”作者用的就是MFI的差值表示。

作者: niwanmao 时间: 2013-6-6 21:50

刘星宇发表于 2013-6-6 21:04

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原来是这样。曾在AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE 文献看到：“Inset: Numbe ...

减法的话，流式专业杂志肯定很难接受。像这本是呼吸病的好杂志，可能其研究结果吸引评审，但这种方法真的接受不了

作者: 刘星宇 时间: 2013-6-6 23:32

niwanmao 发表于 2013-6-6 21:50

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减法的话，流式专业杂志肯定很难接受。像这本是呼吸病的好杂志，可能其研究结果吸引评审，但这种方法真的 ...

又解开一些疑惑了。一直困惑之前的结果，那百分比可以相减的吧？百分比相减后多是正值，虽然数值不高。另外想问，如果检测管比上同型对照管为小于1的值，那很大原因还是背景高所致吧？

作者: david.yanqi 时间: 2013-6-8 22:21
受教了，有个问题，我做出来的流式其荧光表达强度很高啊，算geoMFI有104次方一般，而阴性对照一般都在102次方左右，这时候分析MFI应该怎么办呢？是相除吗？我看文献一般MFI都是几十或是几百的，新手求教，老师不要取笑我啊。。

作者: niwanmao 时间: 2013-6-8 22:28

david.yanqi 发表于 2013-6-8 22:21

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受教了，有个问题，我做出来的流式其荧光表达强度很高啊，算geoMFI有104次方一般，而阴性对照一般都在102次 ...

不叫geomfi，是geomean，该是多少就多少。不过就如上面所讨论那样，能不用mfi尽可能别用

作者: david.yanqi 时间: 2013-6-8 22:33

niwanmao 发表于 2013-6-8 22:28

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不叫geomfi，是geomean，该是多少就多少。不过就如上面所讨论那样，能不用mfi尽可能别用 ...

哎，，我测的那个分子全部100%表达，只有这个mean 存在差异，就在直方图会往左边偏一些，所以只能这样分析，姑且认为两者有差异，不然单从表达来看，就没有阳性结果了，，不知道这样可行不？老师，，谢啦。

作者: niwanmao 时间: 2013-6-8 22:37

david.yanqi 发表于 2013-6-8 22:33

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哎，，我测的那个分子全部100%表达，只有这个mean 存在差异，就在直方图会往左边偏一些，所以只能这样分 ...

嗯，那只能用geomean或者median，看你的分布形态而定

作者: david.yanqi 时间: 2013-6-8 22:43

niwanmao 发表于 2013-6-8 22:37

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嗯，那只能用geomean或者median，看你的分布形态而定

是用得到的geomean除以阴性管的geomean吗?老师，那指标上怎么写呢？percent change of MFI?我都不知道怎么表达好，还是再请教老师一次了，谢谢啦！

作者: niwanmao 时间: 2013-6-9 07:49

david.yanqi 发表于 2013-6-8 22:43

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是用得到的geomean除以阴性管的geomean吗?老师，那指标上怎么写呢？percent change of MFI?我都不知道怎 ...

如果你使用geomean，就用统计学方法直接比较各个样本之间的geomean，或者比较样本除以阴性对照的比值，意义相同。
表述的话，前面就是直接mfi，后面那种方式命名为ratio of mfi

作者: david.yanqi 时间: 2013-6-10 20:10

niwanmao 发表于 2013-6-9 07:49

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如果你使用geomean，就用统计学方法直接比较各个样本之间的geomean，或者比较样本除以阴性对照的比值，意 ...

谢啦，老师！

作者: 刘星宇 时间: 2013-8-20 12:36
本帖最后由刘星宇于 2013-8-20 12:38 编辑

niwanmao 发表于 2013-6-9 07:49

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如果你使用geomean，就用统计学方法直接比较各个样本之间的geomean，或者比较样本除以阴性对照的比值，意 ...

倪老师好，采用MFI分析，还需要设门吗？我们是要看中性粒细胞上面的抗原表达，是直接看圈出来的中性粒细胞群（A）的MFI，还是比较以同型对照设门（B）后的MFI？

Isotype control
[attach]4271[/attach]
检测管
[attach]4270[/attach]

作者: niwanmao 时间: 2013-8-20 15:01

刘星宇发表于 2013-08-20 12:36:20

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倪老师好，采用MFI分析，还需要设门吗？我们是要看中性粒细胞上面的抗原表达，是直接看圈出来的中性粒细胞

只要比较A门内的MFI即可，但是你这两个标本为什么不比较百分比呢？

作者: 刘星宇 时间: 2013-8-20 21:21

niwanmao 发表于 2013-8-20 15:01

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只要比较A门内的MFI即可，但是你这两个标本为什么不比较百分比呢？

原来实验数据是可以比较百分比的，但最近检测管各组之间都在95%~99%，很奇怪，按之前的实验看，百分比没有这么高的，而且差别还算明显的。都高表达了，只好再比较下MFI。

作者: 有中有为 时间: 2013-8-29 22:49

niwanmao 发表于 2013-8-20 15:01

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只要比较A门内的MFI即可，但是你这两个标本为什么不比较百分比呢？

向上面这两个个锋值图，一个纵坐标是55，一个是93，这个东西要不要一致呀？

作者: niwanmao 时间: 2013-8-29 22:52

有中有为发表于 2013-8-29 22:49

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向上面这两个个锋值图，一个纵坐标是55，一个是93，这个东西要不要一致呀？ ...

哦，这个没关系的，你可以设置一样，也可以象上面那样让它自动适应数据。

作者: 有中有为 时间: 2013-8-29 22:55

niwanmao 发表于 2013-8-29 22:52

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哦，这个没关系的，你可以设置一样，也可以象上面那样让它自动适应数据。 ...

那峰值图会不会变的很丑，不会向这样有点正态分布

作者: 有中有为 时间: 2013-8-29 23:18

niwanmao 发表于 2013-8-29 22:52

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哦，这个没关系的，你可以设置一样，也可以象上面那样让它自动适应数据。 ...

纵坐标不一致，它们的中位数有可比性嘛，设置一样的话，会不会影响到它们的中位数，它们的中位数还会和原来一样嘛？

作者: niwanmao 时间: 2013-8-29 23:18

有中有为发表于 2013-8-29 22:55

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那峰值图会不会变的很丑，不会向这样有点正态分布

你觉得这样漂亮就这样显示呗，现在的流式图一般都是自动适应的，就是你上面看到的那样。

作者: 有中有为 时间: 2013-8-29 23:21

niwanmao 发表于 2013-8-29 22:52

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哦，这个没关系的，你可以设置一样，也可以象上面那样让它自动适应数据。 ...

问这些问题是因为我要用中位数来判断MFI的强度，还望老师您能够给予回答

作者: niwanmao 时间: 2013-8-29 23:25

有中有为发表于 2013-8-29 23:21

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问这些问题是因为我要用中位数来判断MFI的强度，还望老师您能够给予回答 ...

纵坐标一样不一样只能说明其获取的细胞数量存在差异，只要细胞不要相差太大，就对中位数影响忽略不计。
你多虑了。

作者: pyhua 时间: 2017-6-13 20:32
老师，我的细胞染了两种颜色的抗体APC-CXC4和PE-CD11b,分析像图中这样，如果我要求CXCR4的MFI的话，应该是用哪一个门里的细胞来分析呢？

作者: niwanmao 时间: 2017-6-13 21:22

pyhua 发表于 2017-6-13 20:32
老师，我的细胞染了两种颜色的抗体APC-CXC4和PE-CD11b,分析像图中这样，如果我要求CXCR4的MFI的话，应该是 ...

得看你要分析哪类细胞，然后那类细胞的表达特点是什么，就圈哪个位置的细胞。
举个例子，我要分析粒细胞的CXC4，那么就选择CD11b高表达、CD45＋的粒细胞，然后再看这类细胞的CXC4 MFI。

作者: pyhua 时间: 2017-6-14 09:20

niwanmao 发表于 2017-6-13 21:22
得看你要分析哪类细胞，然后那类细胞的表达特点是什么，就圈哪个位置的细胞。
举个例子，我要分析粒细胞 ...

就是说我首先需要圈出CD11B+CXCR4+的细胞群，然后计算这一群细胞的CXCR4的MFI，对吗?

作者: niwanmao 时间: 2017-6-14 22:18

pyhua 发表于 2017-6-14 09:20
就是说我首先需要圈出CD11B+CXCR4+的细胞群，然后计算这一群细胞的CXCR4的MFI，对吗? ...

对。

作者: 爱德华医生 时间: 2019-8-7 10:15
请教倪老师，全血染色测MFI有什么注意事项吗？由于只是定体积，没法定细胞，怕有影响

作者: niwanmao 时间: 2019-8-7 10:51

爱德华医生发表于 2019-8-7 10:15
请教倪老师，全血染色测MFI有什么注意事项吗？由于只是定体积，没法定细胞，怕有影响 ...

你指的是什么注意事项？怕测不准？

作者: 爱德华医生 时间: 2019-8-7 11:27

niwanmao 发表于 2019-8-7 10:51
你指的是什么注意事项？怕测不准？

是的，就是怕测得不稳定，我现在是用全血200ul直接染色裂红后上机，看帖子说还要定细胞量不知道全血中是否有必要？还有昨天加了一个Fc Block，然后发现MFI差了25%多，然后就开始怀疑这么检测是否准确

作者: niwanmao 时间: 2019-8-7 14:43

爱德华医生发表于 2019-8-7 11:27
是的，就是怕测得不稳定，我现在是用全血200ul直接染色裂红后上机，看帖子说还要定细胞量不知道全血中是 ...

1、全血裂解后，洗涤一次，会使结果稳定。
2、Fc Block需要加，不加容易不稳定。

作者: 爱德华医生 时间: 2019-8-7 14:59

niwanmao 发表于 2019-8-7 14:43
1、全血裂解后，洗涤一次，会使结果稳定。
2、Fc Block需要加，不加容易不稳定。 ...

全血里的细胞需要定量吗？

作者: niwanmao 时间: 2019-8-8 22:44

爱德华医生发表于 2019-8-7 14:59
全血里的细胞需要定量吗？

定量什么？定量表达分子数还是细胞数？这个看你自己的实验需求。

作者: 爱德华医生 时间: 2019-8-8 22:46

niwanmao 发表于 2019-8-8 22:44
定量什么？定量表达分子数还是细胞数？这个看你自己的实验需求。

谢谢倪老师的耐心解答~

作者: justletitflow 时间: 2019-9-19 17:05
细胞大小怎样影响MFI

作者: niwanmao 时间: 2019-9-19 21:52

justletitflow 发表于 2019-9-19 17:05
细胞大小怎样影响MFI

FSC和SSC的增大，均可导致一定的背景荧光增强，从而使得MFI会有所偏大。

作者: justletitflow 时间: 2019-9-20 10:23

niwanmao 发表于 2019-9-19 21:52
FSC和SSC的增大，均可导致一定的背景荧光增强，从而使得MFI会有所偏大。

老师，处理本身会导致FSC和SSC增大的情况下，某指标荧光峰右移，怎么排除是FSC或SSC的影响？

作者: immunology1988 时间: 2020-4-29 12:37
每天学习一点，积少成多，熟能生巧，谢谢老师！

作者: shjfx 时间: 2020-7-6 11:43

niwanmao 发表于 2017-6-14 22:18
对。

倪老师，这个问题我觉得稍微有点疑问，跟您请教一下。
应该是只圈出CD45+, CD11b高表达的粒细胞群，然后计算这一群的CXCR4 MFI吧？
而不是在CD11b高表达的粒细胞中再圈出CDXR4+细胞，再计算这部分已经定义为CXCR4+细胞的CXCR4 MFI吧？

作者: niwanmao 时间: 2020-7-6 13:58

shjfx 发表于 2020-7-6 11:43
倪老师，这个问题我觉得稍微有点疑问，跟您请教一下。
应该是只圈出CD45+, CD11b高表达的粒细胞群，然后 ...

“只圈出CD45+, CD11b高表达的粒细胞群，然后计算这一群的CXCR4 MFI”
是这个意思

作者: 骑猪上高速 时间: 2020-10-25 10:54

niwanmao 发表于 2020-7-6 13:58
“只圈出CD45+, CD11b高表达的粒细胞群，然后计算这一群的CXCR4 MFI”
是这个意思 ...

倪老师，我想请教一下，像https://www.cytometry.org/web/q_ ... alysis%20Techniques该页面中提到的，

，偏态分布用几何平均数比较好，是因为他接近正态才这样吗？该页面最后的conclusion说最好是median，第二选择才是 geometric mean，那平时计算染色指数还是用geo?

作者: 骑猪上高速 时间: 2020-10-25 10:59

niwanmao 发表于 2020-7-6 13:58
“只圈出CD45+, CD11b高表达的粒细胞群，然后计算这一群的CXCR4 MFI”
是这个意思 ...

倪老师，像https://www.cytometry.org/web/q_ ... alysis%20Techniques里面提到[attach]20736[/attach]，B图是偏态分布，但是他说用geo，是因为这个偏态近似正态吗？偏态的话不是最好是median吗？然后就是这个网页最后的结论说最好使用median,第二选择用geo,那平时计算染色指数还是用geo是吗？

作者: 15955413540 时间: 2021-8-13 16:49

刘星宇发表于 2013-6-5 21:01
是否是同型对照的背景过高了？没有用无荧光抗体拮抗掉非特异性受体？或者洗涤不够？我之前的也是检测管减 ...

请问你增加了洗涤次数之后细胞量有变少吗，我之前也是多洗了一次，结果发现细胞数较之前的少

作者: dongfangyao 时间: 2022-3-1 23:47
请教倪老师，能不能通过染色组与blank组之间MFI的比值在不同细胞系或者不同次实验间定性判断表达丰度呢

作者: Yuck 时间: 2023-6-3 12:46
原来对照细胞的大小也会影响mfi值。学到了。

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