流式中文网

标题: 最近也在做CFSE检测小鼠脾淋巴细胞增殖，请大家帮忙分析 [打印本页]

作者: wolfrog 时间: 2013-6-29 21:00
标题: 最近也在做CFSE检测小鼠脾淋巴细胞增殖，请大家帮忙分析
本帖最后由 wolfrog 于 2013-6-29 21:11 编辑

我的CFSE实验取自红细胞裂解法分离的正常Balb/c小鼠脾淋巴细胞。
CFSE来自Invitrogen 的CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit (C34554)
染色用1uM CFSE 37度10min染细胞（1×10E6cells/ml，1ml）。
5倍体积10%1640培养液冰上5min终止染色，10%1640洗3次。
在24孔板中培养，5×10E5cells/well，1ml/well。
为维持细胞状态加入了终浓度10ng/ml的IL-2，有的孔还加入了anti-CD3 antibody（终浓度1ug/ml）和anti-CD28 antibody（终浓度0.1ug/ml）。看了别的同仁的帖子http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=2479&extra=&highlight=CFSE&page=1，用抗体包被的方法是不是更好？而且发现这位提问者的抗体浓度比我少很多。
刚染色d0天和之后d1d2d3d4都有从孔中取出一些细胞，持续检测CFSE表达水平。
发现CFSE从d1天开始表达下降就很快，而且活细胞群的比例一直很少。d2,d3,d4都没什么区别了。
请大家看看问题在哪里？
是不是我的哪些处理不当，细胞死的太多了？

作者: niwanmao 时间: 2013-6-29 23:20
你将CFSE孵育的时间减少到5分钟试试？

作者: wolfrog 时间: 2013-6-30 14:03

niwanmao 发表于 2013-6-29 23:20

登录/注册后可看大图

你将CFSE孵育的时间减少到5分钟试试？

嗯，谢谢！
还有没有别的要注意的呢？
荧光第一天就下降得特别快是因为细胞活力减低的结果吗？

作者: niwanmao 时间: 2013-6-30 14:52

wolfrog 发表于 2013-6-30 14:03

登录/注册后可看大图

嗯，谢谢！
还有没有别的要注意的呢？
荧光第一天就下降得特别快是因为细胞活力减低的结果吗？ ...

其它方面暂时还看不出来。可以一步一步试着看。
@pushiming77 有没有什么建议？

作者: 木石织梦 时间: 2013-7-1 11:19
我觉得一是细胞状态很重要，染CFSE前要计数，活力测定。我一般是活力达95%以上才往下做。种板前也会做一次活力鉴定。二是胎牛血清要灭活。

作者: samly0 时间: 2013-7-2 09:22
细胞看起来都没活化成，请问从取小鼠脾脏开始到最后铺板成功一共花了多长时间？原代细胞体外处理的时间也是越快越好的，另外建议CFSE的孵育时间再短点。

作者: wolfrog 时间: 2013-7-2 14:46

samly0 发表于 2013-7-2 09:22

登录/注册后可看大图

细胞看起来都没活化成，请问从取小鼠脾脏开始到最后铺板成功一共花了多长时间？原代细胞体外处理的时间也是 ...

我直接在培养液里加CD3和CD28抗体，最终浓度分别是1ug/ml, 0.1ug/ml，这样活化效果如何？是不是用抗体包板的方法更好？
我是从杀鼠一直到最后铺板大约5-6小时。
下次我就准备37度孵育CFSE时间减少到5min

作者: wolfrog 时间: 2013-7-2 14:47

木石织梦发表于 2013-7-1 11:19

登录/注册后可看大图

我觉得一是细胞状态很重要，染CFSE前要计数，活力测定。我一般是活力达95%以上才往下做。种板前也会做一次 ...

请问您是怎么做活力测定的呢，用台畔蓝染色吗？

作者: samly0 时间: 2013-7-2 15:13

wolfrog 发表于 2013-7-2 14:46

登录/注册后可看大图

我直接在培养液里加CD3和CD28抗体，最终浓度分别是1ug/ml, 0.1ug/ml，这样活化效果如何？是不是用抗体包 ...

我们从杀鼠到铺板就2-3个小时呀，原代细胞体外操作的时间越短活性越好，操作步骤上应该没有啥太大的区别，你看看实验过程是不是有些过程可以统筹安排一下时间，以前我们几个实验一起做都是事先先计划好过程，都是在实验室跑来跑去的抢时间的，呵呵

作者: wolfrog 时间: 2013-7-2 15:43

samly0 发表于 2013-7-2 15:13

登录/注册后可看大图

我们从杀鼠到铺板就2-3个小时呀，原代细胞体外操作的时间越短活性越好，操作步骤上应该没有啥太大的区别 ...

嗯，是需要加快点速度。刚刚看了您的protocol中细胞染色时细胞浓度是5 × 10E7 cells/mL，而我做的时候细胞浓度只有1×10E6cells/ml，从没用过这么高的浓度。
我是不是应该增加细胞浓度以防CFSE对细胞活性的影响？

作者: niwanmao 时间: 2013-7-2 15:54

wolfrog 发表于 2013-7-2 15:43

登录/注册后可看大图

嗯，是需要加快点速度。刚刚看了您的protocol中细胞染色时细胞浓度是5 × 10E7 cells/mL，而我做的时候细 ...

细胞多一点，可以抱团取暖：）

作者: wolfrog 时间: 2013-7-2 16:00

niwanmao 发表于 2013-7-2 15:54

登录/注册后可看大图

细胞多一点，可以抱团取暖：）

哈哈，那倒是，看到有的帖子里也说到细胞多可以承受更高的CFSE浓度。但是5×10E7细胞是不是有点多，大半个脾呢……大家都是用这么多吗？

作者: niwanmao 时间: 2013-7-2 16:07

wolfrog 发表于 2013-7-2 15:43

登录/注册后可看大图

嗯，是需要加快点速度。刚刚看了您的protocol中细胞染色时细胞浓度是5 × 10E7 cells/mL，而我做的时候细 ...

至少5×10E6/ml还是要的：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2370-1-1.html

作者: samly0 时间: 2013-7-2 16:13

wolfrog 发表于 2013-7-2 15:43

登录/注册后可看大图

嗯，是需要加快点速度。刚刚看了您的protocol中细胞染色时细胞浓度是5 × 10E7 cells/mL，而我做的时候细 ...

嗯，这也是个办法

作者: samly0 时间: 2013-7-2 16:21

samly0 发表于 2013-7-2 16:13

登录/注册后可看大图

嗯，这也是个办法

每个实验室的条件不一样，这个最好先自己摸摸浓度和孵育时间，因为细胞浓度孵育浓度和时间我都尽量减到最低，所以也怕减过头了导致染色不完全，因此我每次铺板前都会留点细胞上流式看看染色完不完全，也就是看CFSE阳性细胞是不是百分百。可以先做个台盼兰看下活力再铺板加刺激，免得浪费抗体和耗材，一般第二天镜下就能看到明显的活化细胞

作者: wolfrog 时间: 2013-7-2 16:38

samly0 发表于 2013-7-2 16:21

登录/注册后可看大图

每个实验室的条件不一样，这个最好先自己摸摸浓度和孵育时间，因为细胞浓度孵育浓度和时间我都尽量减到最 ...

嗯，非常感谢～！你们刺激活化用的是什么方法，多大浓度呢？

作者: samly0 时间: 2013-7-3 09:39

wolfrog 发表于 2013-7-2 16:38

登录/注册后可看大图

嗯，非常感谢～！你们刺激活化用的是什么方法，多大浓度呢？

IL-2 （终浓度100IU/ml)，anti-CD3 antibody（终浓度2ug/ml）和anti-CD28 antibody（终浓度2ug/ml），Biolegend公司。

作者: pushiming77 时间: 2013-7-3 21:05
以前一个老师结婚，出差了。昨天才回来。
我这个实验也做的很纠结，不过明天又要再次试验这个实验，
对了，我对抗体0.25，0.5，1.0，2.0，4.0进行实验过，看以看到明显的增殖。细胞长的一堆一堆的。这四个梯度基本情况是一样的。所以我觉得不是抗体浓度的问题。我现在都用0.5这个浓度了。
我做这个实验虽然一直没有成功。我觉得可能是CFSE在染色的时候出问题，还不是实验其它部分的问题。得到的增殖细胞可以在10%以上。有时候会更好。
你做实验的时问拉的太长了，本来对细胞的活力都有影响的。一般我在2个时左右。
目前我认为我实验的失败可能是每个细胞染色均匀，以致于增殖锋重叠，而看不到增殖峰，明天想在混匀器的条件试一下，希望有好的结果。
还有你的细胞浓度是不是太少了，我用96板，每well都用了100000或200000，你用24板，是不是细胞太少了。
我的电话是15878397470，有机会可以相互电话讨论这个实验。
哎，好纠结呀。

作者: pushiming77 时间: 2013-7-3 21:06

wolfrog 发表于 2013-7-2 16:00

登录/注册后可看大图

哈哈，那倒是，看到有的帖子里也说到细胞多可以承受更高的CFSE浓度。但是5×10E7细胞是不是有点多，大半 ...

是有一点多哈。1X10E7，我可以接受。

作者: wolfrog 时间: 2013-7-4 09:25

pushiming77 发表于 2013-7-3 21:05

登录/注册后可看大图

以前一个老师结婚，出差了。昨天才回来。
我这个实验也做的很纠结，不过明天又要再次试验这个实验，
对了， ...

谢谢～！我昨天也重新设计了实验做了一下，杀鼠到铺板终于控制在2h20min。染了5×10E6个细胞，用了2uM和1uM两种浓度，37度孵育了5min.
这次用了48孔板，5×10E5cells/well
也发现了染色不均一的问题，虽然都染上了但峰有些宽，之前一个JOVE的视频就是用涡旋的方法混匀的，下次我想这么试试。
还有孵育的过程中略微摇晃一下也许也会好一些。

作者: pushiming77 时间: 2013-7-5 09:26
昨天我用涡旋的方法混匀的试了，后天我才能出结果。好像说的室温，不是37℃。那个视频上也说的是室温。

作者: 木石织梦 时间: 2013-7-5 17:50

wolfrog 发表于 2013-7-2 14:47

登录/注册后可看大图

请问您是怎么做活力测定的呢，用台畔蓝染色吗？

是的

作者: wolfrog 时间: 2013-7-5 20:46

pushiming77 发表于 2013-7-5 09:26

登录/注册后可看大图

昨天我用涡旋的方法混匀的试了，后天我才能出结果。好像说的室温，不是37℃。那个视频上也说的是室温。 ...

刚染完有没有看一看染色均一性如何？我的invitrogen的试剂盒倒说是37℃，确实也看到有人说室温的，哎，众说纷纭啊……

作者: pushiming77 时间: 2013-7-7 14:20

wolfrog 发表于 2013-7-5 20:46

登录/注册后可看大图

刚染完有没有看一看染色均一性如何？我的invitrogen的试剂盒倒说是37℃，确实也看到有人说室温的，哎，众 ...

今天出结果了，和以前一样的，想死的心都有了

作者: wolfrog 时间: 2013-7-7 19:18

pushiming77 发表于 2013-7-7 14:20

登录/注册后可看大图

今天出结果了，和以前一样的，想死的心都有了

今天我的2uM的出了几个峰看到点希望，别灰心，虽然难摸索但肯定能做出来的。大家一起分析分析。

作者: niwanmao 时间: 2013-7-7 19:44

pushiming77 发表于 2013-7-7 14:20

登录/注册后可看大图

今天出结果了，和以前一样的，想死的心都有了

别灰心，实验就是如此，有时候条件都一样，但有可能在某个小小的细节上出了问题，结果就出不来了。多来这里和@wolfrog 等站友交流。

作者: pushiming77 时间: 2013-7-7 21:17
谢谢各位

作者: 木石织梦 时间: 2013-7-8 16:58

pushiming77 发表于 2013-7-7 14:20

登录/注册后可看大图

今天出结果了，和以前一样的，想死的心都有了

细胞染均匀很重要，我一般用37度水浴，然后不停摇匀。可以看到细胞洗涤离心后，透明的黄色。

作者: pushiming77 时间: 2013-7-21 22:45
田丹，我给你几个建议。
1.脾脏细胞10w-30w一个孔（96well）都可以，而且我做出来细胞越多增殖越明显。在显微镜下可以看到明显的细胞堆积。
2.整个实验过程你应该更快一点。1小时40分钟左右完成差不多可以了。一个脾脏就足够了。从脾脏到单一细胞悬液几分钟就可以了（我是将一个脾脏用两镊子夹着柔，一分钟就可以完成，再用1ml的枪吹20-30次过滤就可以了）
3.抗体用得很少，0.25-1.0μg/mL，我多用0.50μg/mL，抗体不是什么问题。用多了，实验成本太高了
4.你也知道染色是关键，我们都到用到涡悬器（见那视频），涡悬太久细胞出现成一堆，吹也吹不开。真不能太久呢，我用1s。染色10min（我的kit上是这样了，还是室温）,每2min小摇动一下，防止细胞沉降，造成染色不匀一（这好像是染色的关键）。
5.终止的时候也要注意快速混匀。

作者: xiaojua 时间: 2013-7-25 16:59
各位前辈，我第一次做这个实验，用的国产碧云天的CFSE，染色前细胞活力很好，但是染色后检测发现活细胞每天都在降低，D1有40%，D2有8%，是不是CFSE的作用呢，碧云天的试剂是CFDASE，没有提供浓度，而且CFDASE进入细胞后代谢为ＣＦＳＥ，浓度难控制吧？实验中加干预组的细胞活力高很多，在D2也有40%。是不是CFSE浓度没有摸好？谢谢

作者: wolfrog 时间: 2013-7-25 17:40

xiaojua 发表于 2013-7-25 16:59

登录/注册后可看大图

各位前辈，我第一次做这个实验，用的国产碧云天的CFSE，染色前细胞活力很好，但是染色后检测发现活细胞每天 ...

碧云天的CFSE没用过，这么看应该是死了不少，可能原因有很多，CFSE的影响是一个方面。前面的回帖里有不少维持细胞活力的建议，可以参考一下。

作者: samly0 时间: 2013-7-30 09:39

木石织梦发表于 2013-7-8 16:58

登录/注册后可看大图

细胞染均匀很重要，我一般用37度水浴，然后不停摇匀。可以看到细胞洗涤离心后，透明的黄色。 ...

呵呵，我是直接丢CO2培养箱孵育的，那里的温度也是37度

作者: liaoyanchun 时间: 2013-8-1 10:40

wolfrog 发表于 2013-7-2 14:46

登录/注册后可看大图

我直接在培养液里加CD3和CD28抗体，最终浓度分别是1ug/ml, 0.1ug/ml，这样活化效果如何？是不是用抗体包 ...

我在做CD4T细胞分选，从杀鼠到分选完毕到培养不到2个小时，我做过分选完立刻表抗体，细胞状态很好，但是一旦养两天后细胞状态就开始直线下降，用CD3 5ug/ml包板，4度过夜，和CD28抗体是游离的，终浓度分别是2ug/ml，但始终达不到我想要的效果，你现在做的怎样了，培养板用的是多少孔的？

作者: wolfrog 时间: 2013-8-4 17:46

liaoyanchun 发表于 2013-8-1 10:40

登录/注册后可看大图

我在做CD4T细胞分选，从杀鼠到分选完毕到培养不到2个小时，我做过分选完立刻表抗体，细胞状态很好，但是 ...

你是用什么方法分选的？磁珠还是流式？磁珠的话阴性分选还是阳性？做完分选立刻标抗体并不能看出来细胞的状态，有可能已经有损伤。你的浓度应该没太大问题，其实不加刺激应该还是有很多细胞保持活性的。试试降低CFSE浓度和增加细胞浓度？多洗几次试试？

作者: wangwei1069 时间: 2013-8-4 22:07
本帖最后由 wangwei1069 于 2013-8-4 22:10 编辑

wolfrog 发表于 2013-8-4 17:46

登录/注册后可看大图

你是用什么方法分选的？磁珠还是流式？磁珠的话阴性分选还是阳性？做完分选立刻标抗体并不能看出来细胞的 ...

请问CFSE染色时细胞的浓度为多少？有的说明书上是1 x 10E6 cells/ml (for in vitro experiments) up to 5 x 10E7 cells/ml (for adoptive transfer). 按着这样应该是1 x 10E6 cells/ml。另外CFSE是直接加到细胞悬液中还是先稀释成2X 的，再与细胞悬液相混合呢？

作者: niwanmao 时间: 2013-8-5 08:30

wangwei1069 发表于 2013-8-4 22:07

登录/注册后可看大图

请问CFSE染色时细胞的浓度为多少？有的说明书上是1 x 10E6 cells/ml (for in vitro experiments) up to 5 ...

参见视频：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2375-1-1.html（观赏密码见帖子正文红色文字）

作者: wangwei1069 时间: 2013-8-28 00:08
经过两个月的实验，CFSE在外周血单个核细胞（PBMC)的实验中终于检测出明显的增殖表现，自己的体会有下面几点：
1、染色时细胞浓度为2*10e6/ml（细胞一定要混匀）。
2、染色时1-2分钟摇晃一次，时间10分钟。
3、终止是一定要迅速，快速混匀。

但是现在我在做外周血CD4+CD25- T细胞培养，却但碰到了问题。

实验方案：先提取外周血单个核细胞（PBMC)，再行磁珠分选CD4+CD25- T，接着行CFSE染色，然后接种到96孔板上（每孔1*10e5），用抗CD3（5ug/ml，提前包被）+CD28（2ug/ml），培养箱里养3天。但显微镜下观察细胞增殖不明显（没有明显成团），行流式（CFSE）检测也无增殖（结果显示已经染上）。在此实验之前，曾经做过外周血单个核细胞（PBMC)的增值实验，方法同上面一样，结果显微镜下细胞增殖很明显（有明显成团），行流式（CFSE）检测也有增殖。请问大家为什么外周血CD4+CD25- T细胞没有明显增殖？问题在什么地方？

作者: niwanmao 时间: 2013-8-28 08:35

wangwei1069 发表于 2013-8-28 00:08

登录/注册后可看大图

经过两个月的实验，CFSE在外周血单个核细胞（PBMC)的实验中终于检测出明显的增殖表现，自己的体会有下面几 ...

是不是因为分选后细胞活力受影响？或者原来的CFSE染色浓度不适合现在的CD4＋CD25－ T？

作者: qingfeng92 时间: 2016-8-8 16:59

木石织梦发表于 2013-7-1 11:19
我觉得一是细胞状态很重要，染CFSE前要计数，活力测定。我一般是活力达95%以上才往下做。种板前也会做一次 ...

血清要灭活的原因是什么？

作者: 木石织梦 时间: 2016-8-8 17:42
血清里含有补体、一些酶类物质，可以杀伤正常的细胞。做原代这种比较脆弱的细胞，都最好灭活一下血清。

作者: qingfeng92 时间: 2016-8-8 22:35

木石织梦发表于 2016-8-8 17:42
血清里含有补体、一些酶类物质，可以杀伤正常的细胞。做原代这种比较脆弱的细胞，都最好灭活一下血清。 ...

Gbico的进口血清也需要吗？

作者: 木石织梦 时间: 2016-8-9 17:46

qingfeng92 发表于 2016-8-8 22:35
Gbico的进口血清也需要吗？

要，什么牌子的都要

作者: coolling 时间: 2022-8-11 16:48
楼主做出来了吗!~!!!?????

欢迎光临流式中文网 (https://flowcyto.cn/bbs/)