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标题: ConA刺激小鼠细胞流式检测方案 [打印本页]

作者: 冰澈澄溪 时间: 2013-11-3 16:22
标题: ConA刺激小鼠细胞流式检测方案
　　　　之前都用ＰＭＡ＋ＩＯＮＯＭＹＣＩＮ刺激小鼠细胞上流式，最近开新课题需要用ＣｏｎＡ刺激，麻烦问一下大家有ＣｏｎＡ刺激细胞分泌细胞因子有具体的实验方案吗？比如用量的参考值什么的？

作者: niwanmao 时间: 2013-11-3 20:19
【从Center for Immunology，Department of Lab Medicine & Pathology，University of Minnesota的主页翻译以下内容，供参考】
体外进行小鼠T细胞多克隆刺激可使用刀豆蛋白A（conA），可同时使CD4和CD8 T细胞活化、增殖、分化。
ConA是一种植物血凝素，可非特异性活化小鼠T细胞，而对B细胞作用微乎其微。本protocol可快速刺激T细胞，一般2天后达到最大的增殖程度。如需产生分化的效应细胞（如CTL效应功能在4－5天时出现），需更长时间的刺激，但此时需减少初始培养的细胞数量，以免细胞增殖过度。

详细步骤：

Mouse spleen cells are prepared as usual into HBSS. Lymph node cells can also be used. Lyse red blood cells with ACK (this may not be necessary but it typically used) for 5 minutes. Add RP10 media and centrifuge. Resuspend in 5 mls of (warmed) RP10 media, count, and adjust the concentration to 2.5 x 10[sup]6[/sup] cells/ml.
Thaw Con A stock vials (1 mg/ml) sufficient for the experiment.
Aliquot 10 ml of cell suspension into a 25 cm[sup]2[/sup] tissue culture flask. Add freshly thawed Con A to a concentration of 2.5ug/ml or 5 ug/ml (i.e. 25ml or 50ml Con A stock per flask). It is best, if possible, to set up flasks at both concentrations of Con A to correct for variability in stimulation.
Stand the flask ON ITS END (i.e. not laid flat but with the loosened cap pointing upwards) in the tissue culture incubator. This is to increase cell-cell contact during stimulation.
Cells proliferate over the next 2 days. Keep an eye on the culture, it should gradually turn yellow as the cells acidify the media, but if it changes color rapidly, this may be contamination. Cell clumps should be very evident from 24 hours onwards. Be careful resuspending the cells before 48 hours as they may be fragile.
At desired times, remove the activated cells and analyze. For functional assays (e.g. CTL activity), it may be necessary to inactivate residual Con A. This can be done by resuspending the cells in a-Methyl Mannoside (50mM in RP10; stock is 20x). a-MM blocks Con A. Cells can be used immediately after addition of a-MM.

备注

Cells can also be stimulated in plates (24-well and 96-well plates have been used in experiments). Similar cell densities and doses of Con A can be used.
Cell densities may need to be reduced if TCR transgenic samples are used (if there are higher percentages of T cells in the sample), to avoid the culture crashing.

试剂
Concanavalin A (also called Con A)
Calbiochem #234567: Mol.Wt. 104,000 (but exists as multimer)
储存液 (100x – 200x) 浓度为1mg/ml，配制方法如下:

Weigh aliquot of Con A powder into a 50ml centrifuge tube (ConA有毒，避免吸引或泼撒). Aim for around 10mg, but determine exact quantity.
Add sterile ddH2O to give approximately 1.2 mg/ml (so, for 12 mg Con A, add 10ml water，记得使用组织培养级塑料或玻璃瓶).
Gently mix and let stand at 4℃for at least 2 hours. Then adjust volume* with ddH[sub]2[/sub]O to give solution of 1mg/ml
Con A does not go completely dissolve and so the solution will be hazy. Some Con A may therefore be lost in sterile filtration. In short term experiments, we have used Con A stocks which are NOT filtered, but if desired, sterilize through a 0.2mm filter.
Store at –20℃ in 100ul～1ml aliquots, depending on application.

a-Methyl Mannoside (also called Methyl-a-D-Mannopyranoside, or a-MM)
Calbiochem #462711: Mol.Wt. 194.2
储存液 (20x) 浓度是1M，配制方法如下：

Dissolve 194.2g a-MM into 800ml RPMI. Once in solution, adjust volume* to 1L.
如果每次用的比较少，可使用下面的量
Or, for small scale…Dissolve 9.71g a-MM into 40ml RPMI. Once in solution, adjust volume* to 50ml.
Sterilize through 0.2 mm filter. Store 25 ml aliquots at -20℃.

作者: 冰澈澄溪 时间: 2013-11-5 13:29

作者: mybiosciences 时间: 2013-11-5 23:06

niwanmao 发表于 2013-11-3 20:19

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【从Center for Immunology，Department of Lab Medicine & Pathology，University of Minnesota的主页翻译 ...

Aliquot 10 ml of cell suspension into a 25 cm2 tissue culture flask. Add freshly thawed Con A to a concentration of 2.5 mg/ml or 5 mg/ml (i.e. 25ml or 50ml Con A stock per flask)
倪老师把单位弄错了

很奇怪，上面是我从原文拷贝过来的，ug变成了mg，ul变成了ml
估计倪老师也是拷贝过来的

作者: niwanmao 时间: 2013-11-6 12:12

mybiosciences 发表于 2013-11-5 23:06

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Aliquot 10 ml of cell suspension into a 25 cm2 tissue culture flask. Add freshly thawed Con A to ...

赞，真仔细，现已纠正，谢谢您的指正！！！

作者: 20071271 时间: 2013-11-7 08:44
PMA是什么原理呢

作者: niwanmao 时间: 2013-11-7 09:34

20071271 发表于 2013-11-7 08:44

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PMA是什么原理呢

T细胞的活化通常是由细胞表面受体与其配体结合后触发的。受体与配体结合后，可通过磷脂酶C使磷脂酰肌醇水解成甘油二酯和肌醇磷酸盐，而甘油二酯是蛋白激酶C的异构性活化因子，肌醇磷酸盐则可启动钙离子动员和释放，从而触发一系列与T细胞活化相关的细胞反应，例如IL-12的分泌。

PMA全称是PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE，其结构上类似于甘油二酯，所以同样可以活化蛋白激酶C。

作者: 20071271 时间: 2013-11-7 12:25

niwanmao 发表于 2013-11-7 09:34

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T细胞的活化通常是由细胞表面受体与其配体结合后触发的。受体与配体结合后，可通过磷脂酶C使磷脂酰肌醇 ...

不知道这两种刺激剂有什么差异，我都是用ConA刺激的

作者: niwanmao 时间: 2013-11-7 14:37

20071271 发表于 2013-11-7 12:25

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不知道这两种刺激剂有什么差异，我都是用ConA刺激的

我觉得刺激增殖的T细胞亚群应该还是有点差别的。看看这篇文章，应该对你有帮助：http://onlinelibrary.wiley.com/d ... 1830220137/abstract

作者: 可可菲 时间: 2013-11-14 16:05

赞一个，又涨知识了~

作者: liyi881228 时间: 2013-11-21 11:53
你好，你能不能发给我一下PMA刺激检测INF-r的具体步骤啊，我最近做的实验加PMA+BFA的CD4+INF-r+比例为55.3%，只加BFA的CD4+INF-r+比例为54.6%，我觉得好奇怪呀

作者: 冰澈澄溪 时间: 2013-11-27 09:26
比例也太高了我估计你是流式分析的时候，划十字门有问题吧。我们做INTRO是提取小鼠的肺跟脾组织里边淋巴细胞。

作者: 以梦为x马 时间: 2015-1-25 10:00
比如用PMA和离子霉素刺激CD4+T细胞，通过抗IL-17染色来检测TH17细胞，这个PMA是促使本来TH17细胞分泌更多的IL-17还是促使CD4+T细胞分化更多的TH17？

作者: niwanmao 时间: 2015-1-25 16:35

以梦为x马发表于 2015-1-25 10:00
比如用PMA和离子霉素刺激CD4+T细胞，通过抗IL-17染色来检测TH17细胞，这个PMA是促使本来TH17细胞分泌更多 ...

PMA主要是活化细胞，促进分泌，而不是分化。

作者: zxtzq526 时间: 2016-12-12 19:07

niwanmao 发表于 2013-11-3 20:19
【从Center for Immunology，Department of Lab Medicine & Pathology，University of Minnesota的主页翻译 ...

老师你好，最近在做ConA刺激淋巴细胞增殖实验，镜下看到细胞明显增殖，但流式抗体染色效果不好，不知是否没有打散成单细胞，导致细胞染不上色，收细胞时需要用什么消化一下吗？

作者: niwanmao 时间: 2016-12-12 20:55

zxtzq526 发表于 2016-12-12 19:07
老师你好，最近在做ConA刺激淋巴细胞增殖实验，镜下看到细胞明显增殖，但流式抗体染色效果不好，不知是否 ...

是否已打散成单细胞，可通过FSC-A/FSC-H散点图看看。你做的是淋巴细胞，不需要消化呀

作者: zxtzq526 时间: 2016-12-13 10:08

niwanmao 发表于 2016-12-12 20:55
是否已打散成单细胞，可通过FSC-A/FSC-H散点图看看。你做的是淋巴细胞，不需要消化呀 ...

我就是不知道为何ConA刺激后细胞就染上流式抗体的比例就很少，对照组是正常的，还望老师指教。

作者: niwanmao 时间: 2016-12-13 12:42

zxtzq526 发表于 2016-12-13 10:08
我就是不知道为何ConA刺激后细胞就染上流式抗体的比例就很少，对照组是正常的，还望老师指教。 ...

做的是什么指标？

作者: zxtzq526 时间: 2016-12-14 10:40

niwanmao 发表于 2016-12-13 12:42
做的是什么指标？

做的就是CD3，CD4，CD8，T淋巴细胞大亚群

作者: niwanmao 时间: 2016-12-14 15:29

zxtzq526 发表于 2016-12-14 10:40
做的就是CD3，CD4，CD8，T淋巴细胞大亚群

PMA是会导致一些标本CD4荧光强度降低，但有些人反映不会。所以你可以破膜之后，再染CD3、CD4、CD8试试。

作者: zxtzq526 时间: 2016-12-14 16:59

niwanmao 发表于 2016-12-14 15:29
PMA是会导致一些标本CD4荧光强度降低，但有些人反映不会。所以你可以破膜之后，再染CD3、CD4、CD8试试。 ...

老师，我用的是ConA刺激的，还有其他蛋白刺激，也有平行培养的不加刺激对照，除了ConA刺激的细胞外，都可以很好的染上CD3、CD4、CD8抗体，这3个是细胞表面标记，应该不用做破膜处理吧。

作者: niwanmao 时间: 2016-12-14 19:21

zxtzq526 发表于 2016-12-14 16:59
老师，我用的是ConA刺激的，还有其他蛋白刺激，也有平行培养的不加刺激对照，除了ConA刺激的细胞外，都可 ...

你可能破膜试试，可能是刺激后像PMA刺激似的发生内吞了。

作者: crystallee89100 时间: 2017-10-11 14:45
倪老师，您好！您这篇帖子解决我一个很大的问题。另外还想请教您，我们是体内干预后取出小鼠脾脏细胞做多色流式，加ConA做胞内因子分泌的阳性对照，这种情况下，应该加入ConA多大浓度、多长时间比较合适呢？急盼复，谢谢倪老师！

作者: niwanmao 时间: 2017-10-12 08:10

crystallee89100 发表于 2017-10-11 14:45
倪老师，您好！您这篇帖子解决我一个很大的问题。另外还想请教您，我们是体内干预后取出小鼠脾脏细胞做多色 ...

取出小鼠脾脏后，制备单个细胞悬液，使其浓度为 1 x 10^5/ml，在96孔板中每孔种入250ul，大多数ConA的终浓度是5ug/ml，可通过每孔加入50ul含ConA的细胞培养基（RPMI 1640，2mM L-Glutamine，10% FBS，30ug/ml ConA ）即可获得此终浓度。

作者: meteorlasting 时间: 2017-11-22 11:42
最开始的问题不是要使用ConA刺激细胞测细胞意因子吗，我也有这个需求，但是后面怎么答非所问啊？
那个步骤好像是刺激细胞扩增的，细胞浓度用的2.5x10^6，比正常PMA刺激时的1x10^6高了好多，而且ConA刺激48h，这个时间太长了吧？感觉如果照上面的方法测细胞因子，可行性并不高啊。至于ConA的浓度，这个买ConA回来的说明书上有，也不需要太担心。

作者: meteorlasting 时间: 2017-11-22 11:44

niwanmao 发表于 2013-11-3 20:19
【从Center for Immunology，Department of Lab Medicine & Pathology，University of Minnesota的主页翻译 ...

最开始的问题不是要使用ConA刺激细胞测细胞意因子吗，我也有这个需求，但是后面怎么答非所问啊？
那个步骤好像是刺激细胞扩增的，细胞浓度用的2.5x10^6，比正常PMA刺激时的1x10^6高了好多，而且ConA刺激48h，这个时间太长了吧？感觉如果照上面的方法测细胞因子，可行性并不高啊。至于ConA的浓度，这个买ConA回来的说明书上有，也不需要太担心。然后不知道该怎么做了

作者: niwanmao 时间: 2017-11-22 14:58

meteorlasting 发表于 2017-11-22 11:44
最开始的问题不是要使用ConA刺激细胞测细胞意因子吗，我也有这个需求，但是后面怎么答非所问啊？
那个步 ...

刺激完了，不就可以收集细胞测胞内细胞因子，或者测血清中的细胞因子吗？

作者: cecily 时间: 2019-7-4 14:14

niwanmao 发表于 2017-11-22 14:58
刺激完了，不就可以收集细胞测胞内细胞因子，或者测血清中的细胞因子吗？ ...

老师，您好！我想请教一下，我用ConA/PHA做阳性对照组，过敏原蛋白做实验组。人的PBMC增殖最好用PHA，小鼠用ConA吗？人的PBMC增殖能否用ConA呢？另外，我想刺激以后看T的增殖情况，一般是要刺激5-7天，这种需要在开始的时候就加IL-2吗？我看我师姐的protocol是不加IL-2就测增殖了。另外，我和她做都发现镜下看细胞成团增殖了，但是上机做CFSE或者EdU测都是单峰，是因为没有加IL-2吗？如果我再标记CD3+和Ki-67看T细胞增殖能力可以吗？

作者: niwanmao 时间: 2019-7-4 14:50

cecily 发表于 2019-7-4 14:14
老师，您好！我想请教一下，我用ConA/PHA做阳性对照组，过敏原蛋白做实验组。人的PBMC增殖最好用PHA，小 ...

你问的问题太笼统，建议站内依次搜索以下关键词：
增殖
CFSE

还有昨天发表的这篇帖子：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-7658-1-1.html

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