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标题: MDSC流式圈门的问题 [打印本页]

作者: immunology 时间: 2018-6-7 16:24
标题: MDSC流式圈门的问题
我做流式的时候，经常对 1. 需要分析的问题不知道应该圈哪群总细胞，还有 2. 圈的门能不能反映细胞的绝对数量的增高，恳请倪老师和大家指点。

比如说，我现在有两种小鼠A和B，想观察某种肿瘤细胞皮下成瘤后，肿瘤中MDSC的浸润情况，看看A，B两种小鼠中的MDSC的浸润数量有没有差异。现在先是看总的MDSC的差异，不先细分G-MDSC和PMN-MDSC。

肿瘤研磨，percoll密度离心分层分离免疫细胞、染色以后上机，那我看MDSC的时候是看所有细胞all events中MDSC中的比例呢，还是需要先找到gr-1，CD11b双阳细胞，反圈门到FSC、SSC上找到相应的位置，然后圈上门P1，看P1门中MDSC的比例？亦或是两种方案均有问题，我对怎么确定细胞总群总是理解不了逻辑精髓，即需要在哪群总细胞中分析我所要的细胞的比例。

第二个问题：我在做肿瘤中CD4 T细胞，CD8 T细胞数量分析的时候，先圈出CD3单阳的整个T细胞群P1，然后P1门内收确定数目（比如20000）的细胞。结果发现A鼠中的CD4 T比例增多，那我现在不知道是CD4 T细胞确实是多了呢，还是CD8 T细胞数目减少导致的CD4 T细胞相对多？流式是不是只能看比例多少，如何确定绝对数量的多少，而不是另一群细胞影响的导致的这群细胞的相对变化？

以上问题肯定大家指点。

作者: immunology 时间: 2018-6-7 17:17
附曹雪涛院士编写的书里的一张图，做的是脾脏中MDSC中的情况。在FSC和SSC中，髓系的MDSC和淋巴细胞看着是能分开的，那我要想看MDSC在两种小鼠A，B肿瘤中浸润的多少，我在FSC和SSC上圈MDSC所在位置P1，然后再在P1门中的gr-1和CD11b图上圈双阳看比例是不是没有什么意义？

作者: niwanmao 时间: 2018-6-7 17:51

immunology 发表于 2018-6-7 17:17
附曹雪涛院士编写的书里的一张图，做的是脾脏中MDSC中的情况。在FSC和SSC中，髓系的MDSC和淋巴细胞看着是能 ...

MDSC的设门是很需要技巧的，之前发过的一些MDSC帖子你可以先看看。

作者: immunology 时间: 2018-6-7 20:36

niwanmao 发表于 2018-6-7 17:51
MDSC的设门是很需要技巧的，之前发过的一些MDSC帖子你可以先看看。

我只查找到了您回答的一个帖子，还是不明白您圈门的道理在什么地方，望您不舍赐教。

作者: niwanmao 时间: 2018-6-8 11:16
Nature Communication这篇文章的设门比较详细，不过可能偏粗一点（https://www.nature.com/articles/ncomms12150#f1）设门方法见下，从左到右依次是骨髓、外周血、脾脏的设门：
[attach]15092[/attach]

你所关心的比例问题，你可以按照自己需要，一般是占活的有核细胞比例，就是通过FSC-A/FSC-H排除粘连体，再通过死活染料排除死细胞，再通过CD45/FSC排除碎片，剩下的活的有核细胞，可作为分母。

作者: immunology 时间: 2018-6-27 02:07

niwanmao 发表于 2018-6-8 11:16
Nature Communication这篇文章的设门比较详细，不过可能偏粗一点（https://www.nature.com/articles/ncomms ...

请问倪老师，CD45/FSC排除细胞碎片是什么意思，查找资料没有查到，能否具体说一下，谢谢您！

作者: niwanmao 时间: 2018-6-27 17:43

immunology 发表于 2018-6-27 02:07
请问倪老师，CD45/FSC排除细胞碎片是什么意思，查找资料没有查到，能否具体说一下，谢谢您！ ...

由于碎片的FSC非常小，而且CD45－，所以通过纵坐标CD45、横坐标FSC，设门排除掉碎片。

作者: yxy0803 时间: 2018-9-9 00:40

immunology 发表于 2018-6-7 17:17
附曹雪涛院士编写的书里的一张图，做的是脾脏中MDSC中的情况。在FSC和SSC中，髓系的MDSC和淋巴细胞看着是能 ...

亲请问这是哪本书呀

作者: phosphor850 时间: 2018-11-30 17:18

niwanmao 发表于 2018-6-7 17:51
MDSC的设门是很需要技巧的，之前发过的一些MDSC帖子你可以先看看。

老师您好,我是做流式的新手，我的这个是4T1乳腺癌荷瘤小鼠血清的MDSC，但我完全不知道该怎么设门，所以想请教您，方便加个QQ吗，[attach]16455[/attach][attach]16457[/attach]

作者: niwanmao 时间: 2018-12-3 15:25

phosphor850 发表于 2018-11-30 17:18
老师您好,我是做流式的新手，我的这个是4T1乳腺癌荷瘤小鼠血清的MDSC，但我完全不知道该怎么设门，所以想 ...

你的目的是什么？如果跟此主题无关的，建议开新帖提问，谢谢！

作者: phosphor850 时间: 2018-12-4 16:51

niwanmao 发表于 2018-12-3 15:25
你的目的是什么？如果跟此主题无关的，建议开新帖提问，谢谢！

倪老师，您好，我不知道该怎么圈图中的MDSC，就是不知道怎么设MDSC的门，这是我以前跟我们有个老师一起做的，但是她后来辞职了，暂时也联系不上她，周围做过流式的也没有做这个MDSC，所以我想请教您该怎么圈MDSC的门??

作者: niwanmao 时间: 2018-12-5 15:34

phosphor850 发表于 2018-12-4 16:51
倪老师，您好，我不知道该怎么圈图中的MDSC，就是不知道怎么设MDSC的门，这是我以前跟我们有个老师一起做 ...

小鼠的MDSC设门，可参考5楼的。不过你的标记好像不够全哦。

作者: jay_joy 时间: 2018-12-10 16:48

immunology 发表于 2018-6-7 17:17
附曹雪涛院士编写的书里的一张图，做的是脾脏中MDSC中的情况。在FSC和SSC中，髓系的MDSC和淋巴细胞看着是能 ...

是来自曹雪涛教授的哪本书？

作者: jay_joy 时间: 2018-12-10 16:54
G-MDSC和PMN-MDSC细胞密度多少？人中性粒细胞的漂浮密度为1.080~1.085g/mL;嗜酸性粒细胞为1.09~1.095g/mL。Percoll分离的话有没有可能会会把G-MDSCs给沉淀到底部，影响实验结果。

作者: niwanmao 时间: 2018-12-12 08:40

jay_joy 发表于 2018-12-10 16:54
G-MDSC和PMN-MDSC细胞密度多少？人中性粒细胞的漂浮密度为1.080~1.085g/mL;嗜酸性粒细胞为1.09~1.095g/mL。 ...

做MDSC这些稀有细胞，不建议Ficoll分，而是建议全血直接染。

作者: mybiosciences 时间: 2019-12-2 18:52
请教一个问题，BD网站搜Ly6G出来两个克隆号，RB6-8C5和1A8，前者anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C，后者Anti-Mouse Ly-6G，两者的Alternative Name都有Gr-1，这两个抗体比较容易混，我的理解是做中性粒细胞要用RB6-8C5，做MDSC要用1A8，不知对不对，在此向各位老师请教，谢谢

作者: niwanmao 时间: 2019-12-3 09:58

mybiosciences 发表于 2019-12-2 18:52
请教一个问题，BD网站搜Ly6G出来两个克隆号，RB6-8C5和1A8，前者anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C，后者Anti-Mou ...

RB6-8C5用的是小鼠的粒细胞作为抗原制备出来的，对Ly-6G亲和力强、对Ly-6C亲和力弱。
1A8用的是Ly-6G转染的EL-4J细胞株作为抗原制备出来的，所以只会结合Ly-6G。
MDSC确实需要按照6C和6G分出gMDSC和mMDSC，后者好一些。

作者: mybiosciences 时间: 2019-12-4 07:06
感谢倪老师的耐心回答，谢谢

作者: immunology 时间: 2020-3-7 05:52

niwanmao 发表于 2019-12-3 09:58
RB6-8C5用的是小鼠的粒细胞作为抗原制备出来的，对Ly-6G亲和力强、对Ly-6C亲和力弱。
1A8用的是Ly-6G转染 ...

倪老师，我一直有个疑问，一直以来很多文献都说Gr-1这个marker包括Ly6G和Ly6C，那么Gr-1全称是什么呢？

我查ncbi和文献都没有对这个marker有过详细的解释，ncbi上的Gr-1跟Ly6G是同义词，是Ly6G的别名。那么Gr-1包括Ly6G和Ly6C这个出处在什么地方呢？Gr-1到底是什么分子或者分子复合体？

作者: immunology 时间: 2020-3-7 06:00

jay_joy 发表于 2018-12-10 16:48
是来自曹雪涛教授的哪本书？

<流式细胞术原理、操作及应用>

作者: niwanmao 时间: 2020-3-8 12:22

immunology 发表于 2020-3-7 05:52
倪老师，我一直有个疑问，一直以来很多文献都说Gr-1这个marker包括Ly6G和Ly6C，那么Gr-1全称是什么呢？

...

Gr-1的全称就是granulocyte receptor-1 antigen，指的就是Ly6C/Ly6G复合体。

作者: immunology1988 时间: 2020-11-12 08:52
求曹院士编写的哪本书！谢谢

作者: stepvenmei3 时间: 2020-12-30 08:55

niwanmao 发表于 2018-6-8 11:16
Nature Communication这篇文章的设门比较详细，不过可能偏粗一点（https://www.nature.com/articles/ncomms ...

老师，您好！最近我也在做小鼠脾中MDSC的检测，想请问下最一开始FSC-SSC图中应该如何设门比较合适？第一次做小鼠脾MDSC检测，发现设门总是弄不到位导致结果不理想。另外，如果我光用CD11b和Gr-1作为MDSC的表面标记物进行染色是不是还不够，打算再补充一个CD16的指标，老师您觉得是否合适呢？谢谢您！

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