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标题: 流式染色细胞固定破膜后再染表现marker可以么 [打印本页]

作者: yxzxlmlf 时间: 2018-8-2 09:32
标题: 流式染色细胞固定破膜后再染表现marker可以么
RT，一定要先染完表面marker后固定破膜再染胞内因子吗？可不可以固定破膜后胞外胞内一起染色？比如PMA诱导完淋巴细胞后CD4会降低，所以倪老师的一个帖子里http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-6801-1-1.html介绍说可以CD4固定破膜后再染，才有此疑问。流式小白请教大家，谢谢！

作者: niwanmao 时间: 2018-8-2 09:32
1、可以，但是要摸索，因为有些表面标记被固定之后，可能构象发生改变，就结合不上了。
2、那个帖子里面，之所以推荐试试固定破膜后再染，并不是针对表面，而是因为可能CD4在刺激之后发生部分内化，所以破膜之后能使其充分暴露，容易被测到。大概这样的思路。

作者: yxzxlmlf 时间: 2018-8-3 09:23

niwanmao 发表于 2018-8-2 09:32
1、可以，但是要摸索，因为有些表面标记被固定之后，可能构象发生改变，就结合不上了。
2、那个帖子里面， ...

谢谢倪老师！除了CD4，其他的CD分子还是先染后固定的，我试了下CD4固定破膜后再染，还行，可以染上，阴阳分群明显

作者: niwanmao 时间: 2018-8-3 11:49

yxzxlmlf 发表于 2018-8-3 09:23
谢谢倪老师！除了CD4，其他的CD分子还是先染后固定的，我试了下CD4固定破膜后再染，还行，可以染上，阴阳 ...

是的，PMA刺激后，主要是对CD4影响。

作者: wjd850801 时间: 2019-10-24 13:35
请问一下，一般细胞固定和破膜，试剂的浓度、作用时间和温度，如何确定

作者: niwanmao 时间: 2019-10-25 07:47

wjd850801 发表于 2019-10-24 13:35
请问一下，一般细胞固定和破膜，试剂的浓度、作用时间和温度，如何确定

商品化试剂都有说明书的。

作者: wjd850801 时间: 2019-11-4 15:48

niwanmao 发表于 2019-10-25 07:47
商品化试剂都有说明书的。

谢谢倪老师

作者: gaga1989xl 时间: 2019-11-5 10:00
在文献上看到CD69也推荐破膜后再染(CD69 is up-regulated on T cells within 6 hr of activation. Antigen-speciﬁc cytokine detection can be enhanced by demonstrating the coexpression of CD69 and the cytokine(s) of interest (Waldrop etal., 1997). The anti-CD69 MAb is typically added during the intracellular staining step, as secretion inhibitors such as BFA will prevent the surface expression of the newly produced CD69 protein.
)。另外：请教各位战友，是否遇到PMA刺激后CD3表达降低分群不明显的？如何解决，也是破膜后染吗？

作者: niwanmao 时间: 2019-11-5 11:51

gaga1989xl 发表于 2019-11-5 10:00
在文献上看到CD69也推荐破膜后再染(CD69 is up-regulated on T cells within 6 hr of activation. Antigen- ...

CD3不会的。

作者: wjd850801 时间: 2019-11-6 10:48

niwanmao 发表于 2019-10-25 07:47
商品化试剂都有说明书的。

倪老师，还有个问题想请教一下，当我们开发一个新方法时，涉及到的参数如果没有质控，如何做方法学验证中的准确度一项呢

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