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标题: 胞内染色固定和破膜，是不是会使GFP失效？ [打印本页]

作者: liyingqilyq 时间: 2021-6-21 13:22
标题: 胞内染色固定和破膜，是不是会使GFP失效？
请问如何通过胞内染色去流式检测到GFP？

作者: niwanmao 时间: 2021-6-21 15:00
乙醇固定肯定不行。
多聚甲醛，固定有技巧，可以优化，见文献（https://www.future-science.com/doi/pdf/10.2144/000113780），里面提到，0.5％固定半小时以上，或1％固定15分钟以上，可保留YFP的荧光，所以对于GFP，也是类似。稳妥起见，我建议你可以用1％固定30分钟以上。
[attach]21969[/attach]

作者: 飞翔 时间: 2021-6-21 16:02

niwanmao 发表于 2021-6-21 15:00
乙醇固定肯定不行。
多聚甲醛，固定有技巧，可以优化，见文献（https://www.future-science.com/doi/pdf/10 ...

倪老师，你好，问下胞内染色中固定及破膜对细胞的CFSE是否会失效

作者: niwanmao 时间: 2021-6-22 08:01

飞翔发表于 2021-6-21 16:02
倪老师，你好，问下胞内染色中固定及破膜对细胞的CFSE是否会失效

这方面问题暂时未看到。你碰到了？

作者: sunny2829 时间: 2021-6-22 10:25

飞翔发表于 2021-6-21 16:02
倪老师，你好，问下胞内染色中固定及破膜对细胞的CFSE是否会失效

看了BD CFSE说明书，不会失效哦。看下图以及说明书[attach]21970[/attach][url=]565082 BD CFSE.pdf[/url]

作者: 飞翔 时间: 2021-6-22 12:44

sunny2829 发表于 2021-6-22 10:25
看了BD CFSE说明书，不会失效哦。看下图以及说明书565082 BD CFSE.pdf

作者: 刘小六 时间: 2021-7-21 09:45
打扰！我昨天做了转染细胞后的Ki67破膜染色，发现eGFP荧光完全丢失，用的是赛默飞的破膜液，不懂是不是会有影响

作者: niwanmao 时间: 2021-7-21 17:19

刘小六发表于 2021-7-21 09:45
打扰！我昨天做了转染细胞后的Ki67破膜染色，发现eGFP荧光完全丢失，用的是赛默飞的破膜液，不懂是不是会有 ...

建议参考2楼的固定方法，然后再用Thermo的破膜剂。

作者: 刘小六 时间: 2021-8-2 09:53

niwanmao 发表于 2021-7-21 17:19
建议参考2楼的固定方法，然后再用Thermo的破膜剂。

好的，谢谢您！

作者: huoyingying 时间: 2021-10-15 17:41
求问， anti-human Lineage Cocktail(CD3,CD14,CD16,CD19,CD20,CD56)表染后，再对细胞破膜，会导致该通道的阴性群消失吗？也就是说我在破膜后上机，lin-的群不见了

作者: niwanmao 时间: 2021-10-15 21:08

huoyingying 发表于 2021-10-15 17:41
求问， anti-human Lineage Cocktail(CD3,CD14,CD16,CD19,CD20,CD56)表染后，再对细胞破膜，会导致该通道的 ...

不应该啊，是不是非特异性染色？

作者: huoyingying 时间: 2021-10-15 21:49

niwanmao 发表于 2021-10-15 21:08
不应该啊，是不是非特异性染色？

感谢老师的回复，也看过老师之前说的Fc阻断剂的帖子，有一条说人的细胞样本不阻断问题不大，而且因为要看的目标群属于中性粒细胞前体阶段，可能也会表达CD16，这种情况我应该加Fc阻断剂吗？

作者: niwanmao 时间: 2021-10-16 09:06

huoyingying 发表于 2021-10-15 21:49
感谢老师的回复，也看过老师之前说的Fc阻断剂的帖子，有一条说人的细胞样本不阻断问题不大，而且因为要看 ...

不用啊。我们平时免疫分型经常做的，CD16是晚幼粒附近开始表达，所以不知道你要检测哪个阶段。

作者: huoyingying 时间: 2021-10-16 16:43

niwanmao 发表于 2021-10-16 09:06
不用啊。我们平时免疫分型经常做的，CD16是晚幼粒附近开始表达，所以不知道你要检测哪个阶段。 ...

感觉阶段类似G-MDSC，所以可能会有CD16，那这种破膜后lineage的非特异性染色，我应该怎么处理呢？

作者: niwanmao 时间: 2021-10-17 09:22

huoyingying 发表于 2021-10-16 16:43
感觉阶段类似G-MDSC，所以可能会有CD16，那这种破膜后lineage的非特异性染色，我应该怎么处理呢？ ...

Lin预混抗体中的CD16要去掉。

作者: huoyingying 时间: 2021-10-17 16:14

niwanmao 发表于 2021-10-17 09:22
Lin预混抗体中的CD16要去掉。

感谢倪老师耐心指导，那我用lineage cocktail用一个不带CD16的？还需要加Fc阻断剂吗？

作者: niwanmao 时间: 2021-10-18 09:34

huoyingying 发表于 2021-10-17 16:14
感谢倪老师耐心指导，那我用lineage cocktail用一个不带CD16的？还需要加Fc阻断剂吗？ ...

想做的规范一些，加。

作者: huoyingying 时间: 2021-10-18 17:47

niwanmao 发表于 2021-10-18 09:34
想做的规范一些，加。

好的，感谢倪老师的耐心解答。

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