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标题: 流式测线粒体膜电势 [打印本页]

作者: maple032023 时间: 2011-6-5 12:58
标题: 流式测线粒体膜电势
第一次测线粒体膜电势,使用rh123染色,检测control与加药12小时组.结果如图所示.请问这个结果能说明我的样品作用了12小时之后导致了线粒体膜电势降低吗?我看别的文献样品处理的都有双峰,我这个怎么只是有峰位移呢?还有我这个时间是作用的效果比较强呢还是比较弱呢?我想要做时间依赖性,是应该增加还是应该减少药物作用时间呢?[attach]244[/attach][attach]245[/attach]

作者: niwanmao 时间: 2011-6-5 12:58

maple032023 发表于 2011-6-5 23:04

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可是这个rh123检测膜电位的原理到底是什么啊?难道网上写的这个错了?"罗丹明123（Rho ...

我明白你的困惑了，你所说的这原理我查了下，是很多博客里面写的，其应用都是在光镜观察下。
首先，你需要知道罗丹明123的特性，它可以自由通过细胞膜，而线粒体膜，则需要电位维持才能摄取。
这样就可以解释了，因为光镜检查时，需要对细胞进行固定，所以释放出来的罗丹明123就可以固定在胞浆中，不会漏到胞外，从而在光镜下受荧光激发而被观察到，这样胞浆的荧光自然是增强的。
而在流式细胞术中，我们在用罗丹明123孵育后会进行一次洗涤（见protocol：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=191），这时，凋亡细胞因为线粒体膜电位的下降，把罗丹明123释放到胞浆，这些罗丹明123由于其自由通过细胞膜的特性，会非常顺利的通过细胞膜释放到胞外，洗涤的时候，就把这些罗丹明123都洗去了，所以最后检测到的大部分是那些残留在线粒体内的罗丹明123，自然就降低了。
这样的解释能明白吗？:)

作者: maple032023 时间: 2011-6-5 16:38
好像不对啊,荧光增强是线粒体膜电势增强吗?我看文献上都是药物导致线粒体膜电势崩溃而荧光减弱啊,应该左移.我这个做的有问题吧!可是明明所有的网站上都写着"罗丹明123（Rhodamine 123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂。其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质,荧光强度减弱或消失。而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光",这样看应该是细胞发生调亡时线粒体膜电为降低,rh123释放出线粒体,发出强荧光,那就是说荧光应该增强啊!弄不明白了

作者: niwanmao 时间: 2011-6-5 17:57

maple032023 发表于 2011-6-5 16:38

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好像不对啊,荧光增强是线粒体膜电势增强吗?我看文献上都是药物导致线粒体膜电势崩溃而荧光减弱啊,应该左移. ...

没错，线粒体电位降低，R123荧光增强。你的结果是正确的。
要出现双峰，可以把control和处理组结果叠加即可。
http://mic.sgmjournals.org/cgi/content/full/147/12/3335/F2

作者: maple032023 时间: 2011-6-5 19:26
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但您看看这篇文献:http://www.sciencedirect.com/sci ... 36&searchtype=a结果部分的这句话"the integrity of the mitochondrial membreane in cells was examined by rhodamine 123 staining, and the decrease in rhodamine 123 fluorescence intensity reflected potential decrease",而且实验结果也是峰位左移.这篇文献是很清楚的说出来,还有很多文献也得到一样的结果的,都是电势降低,荧光减弱.这怎么解释呢?

作者: niwanmao 时间: 2011-6-5 20:51

maple032023 发表于 2011-6-5 19:26

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但您看看这篇文献:http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleListURL&_meth ...

sorry，是我看错了。
前面这篇文章中（http://mic.sgmjournals.org/cgi/content/full/147/12/3335#F2），线粒体膜电位去极化（即电位降低）是荧光降低，结论当中也是如此写的：In the two yeast species tested under the optimized staining conditions, an increase or decrease in the R value of stained yeast cell suspensions was observed after treatment with hyperpolarizing (substrate of mitochondrial respiration) or depolarizing (ionophores or specific inhibitors of respiration) agents, respectively.
前面我把他们结果图片中的罗丹明浓度当成了药物浓度，所以看上去就是随着浓度增高而荧光强度增高了。难怪刚才总觉得怎么跟以前看到的不太一样。

不知道你使用的是什么药物？是否肯定能造成线粒体膜电位降低的？

作者: maple032023 时间: 2011-6-5 23:04
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可是这个rh123检测膜电位的原理到底是什么啊?难道网上写的这个错了?"罗丹明123（Rhodamine 123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，是一种线粒体跨膜电位的指示剂。其在正常细胞中能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质,荧光强度减弱或消失。而在凋亡发生时，线粒体膜完整性破坏，线粒体膜通透性转运孔开放，引起线粒体跨膜电位(ΔΨm) 的崩溃, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出强黄绿色荧光".这个意思明明就是产生调亡膜电位降低荧光增强啊!不然这个原理应该怎么解释呢?我的药物在24小时导致明显的早期凋亡,晚期凋亡也开始增加,并且早期凋亡随着时间增加而增加,所以我觉得必然膜电势要降低的啊!但是我这次测得是12小时,我明天再做24小时和36小时的,看看是不是有变化.不过做了半天试验连原理都没搞清楚,真是惭愧啊!到底是什么原理啊?为什么电势降低荧光也降低啊?

作者: maple032023 时间: 2011-6-6 10:20
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明白了,谢谢老师!

作者: maple032023 时间: 2011-6-6 16:36
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我今天又测了24小时和36小时的线粒体膜电势,如图所示从上到下依次为:control,24小时,36小时.我这次忘了设门,没有把死亡的细胞去除,可能导致前面有杂峰吧.为什么只有control有双峰呢?是不是有问题呢?control和24小时重叠起来没觉得峰位有变化,但是从mean值来看24小时降低了大约30%,而36小时跟24小时持平.这个结果正常吗?另外,与昨天12小时的对比,如果FL-1电压与昨天相同,那么control的峰位不在10-2上,为了保证control峰位在10-2上,我又把电压调小.是应该每次都固定control峰位在10-2上呢?还是固定每次电压恒定呢?
[attach]246[/attach]

作者: niwanmao 时间: 2011-6-6 20:38

maple032023 发表于 2011-6-6 16:36

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我今天又测了24小时和36小时的线粒体膜电势,如图所示从上到下依次为:control,24小时 ...

这类log模式下获取的数据还是应该使用Geo mean，而不是mean值，至于为什么，请参见：http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=799

所以，你这批数据的确是没什么明显区别。至于原因，我觉得你要从以下几个方面找：
1、孵育后是否已充分用PBS洗涤？
2、你使用的药物是否肯定会造成线粒体膜电位降低？
……

至于获取电压是否固定，我觉得无所谓。

作者: maple032023 时间: 2011-6-12 12:47
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我又做了一次,测了加药作用0,6,12,24小时的Rh123膜电势检测,跟上次差不多,随着时间的增高荧光逐渐增强.

.可是我的药物在24小时的时候就可以看出明显调亡,48小时调亡已经达到将近50%.一般来说导致调亡了电势膜应该降低啊!所以我觉得药物肯定应该有作用的啊!
至于背景是否洗净,这点我真不太确定.我按照我一个朋友的方法,1mlPBS细胞悬液里面加了10微升rh123 1mg/ml储备液(终浓度10微克/ml),加进去之后能看见细胞悬液明显变绿,这个量是不是太多了呢(我的是hela细胞)？37度30分钟后用PBS洗两遍(离心条件:300g 5min),但是仍然可以看见离心下来沉淀在管底的细胞呈红色.再用PBS悬浮之后就没有颜色了.就直接测了.你说这是没有洗干净吗?但是我觉得要是没洗干净就都没有洗干净啊,哪能只有加药的没洗净的道理呢?

作者: niwanmao 时间: 2011-6-12 17:04

maple032023 发表于 2011-6-12 12:47

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我又做了一次,测了加药作用0,6,12,24小时的Rh123膜电势检测,跟上次差不多,随着时间 ...

下面表格中是罗丹明123的化学特性，我按照罗丹明123的分子量，算了下，与protocol（http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=200）相比，你的储存液浓度2.6mM，高26倍，工作液终浓度是26μM，高2倍多。

Synonym:	2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester
CAS Number:	62669-70-9
Linear Formula:	C21H17ClN2O3
Molecular Weight:	380.82
Beilstein Registry Number:	6030951
EC Number:	263-687-8
MDL number:	MFCD00012664
PubChem Substance ID:	24899403 登录/注册后可看大图

因此，我觉得会不会是因为浓度过高的问题。即使储存液不管它，至少工作液的浓度应该还是不要高这么多。另外，储存液需要用甲醇充分溶解，不知道你是否也是这么做的？

作者: maple032023 时间: 2011-6-12 20:03
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我是用水制备的储备液,因为之前人都用水溶解的,没有问题.储备液浓度1mg/ml也都可以溶解.就是工作浓度我也不确定,我是看文献上都用10mg/ml,我也就这么做的.可是洗了两遍之后沉淀下来的细胞还是能看见红色,我也怕是不是没洗掉呢?不过无论是control还是加药组都一样,都能看见细胞是红色的.不过我通过ＳＳＣ和ＦＳＣ图上可以看出细胞变大．我觉得细胞变大也有可能导致荧光增加．所以总体来说如果是ｃｏｎｔｒｏｌ组合加药组都没有洗净，而且加药组细胞变大导致荧光增加，也可以解释这个结果．不知道我这么想有没有道理？
如果我分析的有道理，那我就还是应该重复一遍，工作浓度降低一倍，５ｍｇ／ｍｌ，再试一下．主要是如果染色后洗干净了是不是细胞应该是跟没染色的细胞一样，都无色，不应该看出红色的呢？我是不是这一步出了错误？还是应该我多洗几遍呢？我朋友做过说洗两遍应该没有问题了啊

作者: niwanmao 时间: 2011-6-13 09:02

maple032023 发表于 2011-6-12 20:03

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我是用水制备的储备液,因为之前人都用水溶解的,没有问题.储备液浓度1mg/ml也都可以 ...

看来Hela细胞的R123检测结果的荧光就是如此不稳定，分析时正常细胞峰的位置是会发生变动的。是应该分析左侧的峰的，你看这篇文章页码为1626的那一页图片：http://www1.syphu.edu.cn/jpk/hxzygyx/materials/3-4-2/21.pdf，分析左侧峰的比例，即可反映出线粒体膜电位的DISRUPTION。

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