多色标记抗体的流式实验要怎么设置对照？

niwanmao

首先用空白对照调节电压，这部分数据可以不保存，主要是了解一下电压大概在什么水平可以使细胞出来，同时又不会跑的太外面。

然后用FMO对照调节各个通道之间的补偿：
就是一共4个抗体，依次拿掉一个，组合出4组搭配（PE/APC/APC-CY7、FITC/APC/APC-CY7、FITC/PE/APC-CY7、FITC/PE/APC），用来细调电压和通道之间的补偿。
如果你是BD的机器，由于FITC、PE这两种与APC、APC-CY7两种之间不存在补偿，我个人觉得可以只用FITC单标、PE单标、APC单标、APC-CY7单标来调。

niwanmao

willow2013 发表于 2013-2-22 12:48

                               
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倪老师好，我对流式了解的很少，问些问题希望您不要见笑。
您说的FMO对照的设置，即4种抗体中的3种组合， ...

抗体用量就按照说明书好了，标准用量，就是说本来你标本是用4个抗体一起染的，现在减掉一个，去调节其它通道漏到这个通道的荧光。
FITC单标，看看FITC到底有多少荧光漏到PE通道，即调节PE减去多少FITC。
PE单标，调节FITC减去多少PE。
APC单标，调节APC-CY7减去多少APC。
APC-CY7单标，调节APC减去多少APC-CY7.
所谓单标，就是拿4个流式管，往里面按标准用量各加一个抗体，然后每管里面再加入100ul标本，按正常步骤孵育、裂解、上机。

niwanmao

willow2013 发表于 2013-2-22 13:00

                               
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哦，那如果用的是BD的机器，FMO对照可以不用了，就只用FITC单标、PE单标、APC单标、APC-CY7单标来调就可 ...

从原理上来说，这几管单标也可以算是FMO，只不过因为前两个和后两个之间不需要调节补偿，就分开来设FMO。

你用BD的机器的话，4个单标就行了。

niwanmao

willow2013 发表于 2013-2-22 13:03

                               
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还想问您个问题，我之前定BD直标抗体的时候，没有定购同型对照，这样检测还有意义吗？有没有什么方法能补救 ...

FMO对照就比同型对照更有参考意义。

niwanmao

willow2013 发表于 2013-2-22 13:11

                               
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哦，我看有的文献做三色标记的时候，没有FMO对照，只用了IG1-FITC，IG1-PE，IG1-APC，IG1-APC-Cy7的同型 ...

FMO对照首选、同型对照次选、空白对照不推荐。等会儿我会发一篇资料，你看看资料里面的图，FMO对照怎么用。多看国外文章。

niwanmao

willow2013 发表于 2013-2-22 13:14

                               
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如果我只用了FITC-A单抗，PE-B单抗，没有同型对照IG1-FITC，IG1-PE的话，可以吗

可以。

niwanmao

willow2013 发表于 2013-2-22 13:22

                               
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好的，谢谢您！

http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2114-1-1.html 的分析图示中有FMO对照。