鱼类多倍体检测（DNA含量），十万火急！

niwanmao

jordanping23 发表于 2014-4-14 11:58
是红细胞核里的DNA含量，根据不同含量来确定倍性。鱼类的红细胞是有细胞核的。 ...

鱼类没做过，根据你的描述，鱼类应该都是有核红，但是你即使经过洗涤，其中的白细胞应该还是不少的。
不知道鱼类的红细胞大小是不是也象人类那么小，如果很小的话，得通过FSC（log）/SSC(log)设门来圈，象你上面用Lin模式圈出的基本上应该都是白细胞。
至于周期的分析，还是需要用Modfit这类专业软件分析。

为了确定多倍体，我觉得你是不是可以找一种单倍体作为标准参照？

niwanmao

jordanping23 发表于 2014-4-14 19:34
1、确定是否是多倍体，找一个确定是二倍体的同一种的鱼，通过二者的DNA含量对比就可以实现，不需要单倍体 ...

我们平时做的比较多的是正常人和肿瘤标本的细胞，采用的是细胞悬液滴入乙醇的方法，边滴边振荡。对乙醇量没有规定，一般乙醇量尽量多一点。

如果无论如何你都无法解决絮状沉淀的问题，我建议你试试BD Cycletest plus，那个试剂盒可以直接处理新鲜标本，无需用乙醇固定。不过我只用这个试剂盒做过人外周血和骨髓标本，未做过鱼类的，从原理上看应该可行，你实在没办法时可以试试。

niwanmao

jordanping23 发表于 2014-4-14 21:30
谢谢！你们做人外周血的时候没碰见过絮状沉淀么？做人外周血和鱼类应该是差不多的，我大概0.1ml的纯红细 ...

做人的外周血从来没碰到过，反而做培养的细胞时碰到过，一般是由于细胞状态差。
不过我们平时做的都不是红细胞，而是白细胞、肿瘤细胞等，所以对乙醇抵抗能力较强，估计红细胞膜比较脆弱，所以容易被乙醇破坏而死亡。

所以，我建议你可以从别人那里先借用一个test的BD Cycle test plus试试。

niwanmao

jordanping23 发表于 2014-4-14 22:38
BD Cycle test plus 什么价格？

具体价格忘了，印象中千元左右。
如果你在杭州的话，我可以给你一个test。

niwanmao

jordanping23 发表于 2014-4-14 23:10
我在湖州。不过test用不用没关系，我主要是在找出试验的问题出在哪，相信经过大家的努力和自己不断的实验 ...

直接加70％乙醇，不管终浓度。

niwanmao

jordanping23 发表于 2014-4-15 21:24
倪老师，细胞周期试剂盒我有的，明天打算试一下。我看到步骤是这样的：2、外周血DNA样本的制备（CycleTES ...

因为你要做红细胞，所以溶血素不能用，要把2.2～2.4这三步跳过。
最后2.8步过滤看情况，如果没有团块，也可跳过。

niwanmao

jordanping23 发表于 2014-04-15 23:28:15

                               
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洗涤都不需要了吗？

洗涤不是必要步骤，没关系的

niwanmao

jordanping23 发表于 2014-04-16 22:48:40

                               
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细胞周期试剂盒里面的Buffer solution里面含有抗冻剂DMSO，是否可以作为样品储存液放在-80℃保存？

用buffer做标本保存液没有试过。

niwanmao

jordanping23 发表于 2014-4-17 21:38
倪老师，这些参数我这么设置，正确吗？为了能直接得到数值，判断倍性，第三个图的M1、M1是这么设置的吗？ ...

你的机器上安装了Modfit，为什么不用Modfit来分析？

niwanmao

jordanping23 发表于 2014-4-17 22:05
做这个实验，主要有两个目的，首先是定性，通过不同个体的DNA含量，来确定倍性，直接从结果上就可以一眼看 ...

既然又要定性，又要定量，为什么不直接用modfit分析呢？
如果你要定性，首先需要用鸡红细胞确定单倍体位置，然后根据如下图片这样，从荧光强度判断其倍体类型：

确定倍体