胞内染色问题

mimikiity

做过好几次，为什么胞内的蛋白总是染不出来呢，老师帮忙指点指点。
我的方法如下：
1,收集细胞，加anti-mouse CD4，CD25抗体，轻柔混匀，4℃避光孵育20min.
2,staining buffer 洗两遍，弃上清，每个样本加入100μl Fixation/permeabilization 试剂，室温孵育20min或4℃孵育过夜。
3,直接加入2ml perm buffer洗两遍，弃上清。
4,加入胞内抗体IL-17，FoxP3（抗体按一定量直接加入残余液中） ,室温避光20min。
5，直接加入2ml perm buffer洗两遍，弃上清，500μl staining buffer 重悬，上机。

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niwanmao 发表于 2013-11-7 14:16

                               
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看结果，确实都没染出来。
我的建议是：
1、不知道你使用的是什么破膜剂？foxP3是细胞核内的，而IL-17是胞 ...

我两个是用的同一种破膜剂，都是染胞内的破膜剂。我再查查资料，谢谢老师

mimikiity

dragonhzqsmmu 发表于 2013-11-7 13:12

                               
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细胞内因子检测需要加入离子霉素刺激，另外还要高尔基体抑制剂防治刺激出来的因子分泌出去，你这个好像没有 ...

加了的，在收集细胞5h之前加了ebioscience的Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) 。