小鼠皮下瘤免疫细胞流式结果分析

Reyna

各位老师好，本人最近做了一批小鼠，实验方案是取C57小鼠MC38细胞皮下瘤剪碎，用胶原酶I（2mg/ml），胶原酶IV（2mg/ml），DNaseI（0.2mg/ml）消化1个小时左右（实际上只在37℃敷箱里消化了30-40分钟，后面因为吃饭先把细胞放冰上了再处理的）制作单细胞悬液，用流式抗体Alexa Fluor® 700 CD3ε、FITC CD4、APC CD8a、Brilliant Violet 510™ CD19、Brilliant Violet 421™ NK-1.1、PerCP/Cyanine5.5 CD11b、PE F4/80、Brilliant Violet 605™ CD11c、PE/Cyanine7 CD45、Zombie NIR™ Fixable Viability Kit十色放一管里不分组染色标记CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、B细胞、NK细胞、TAM、DC细胞，看各处理组免疫细胞比例的差异，上机这块流式实验方案是之前建立好了，并且已经请公共平台的老师调过补偿了的，固定过后第二天直接上机测的，拿到数据分析过程中还是有两点疑惑，希望各位老师能够解答。

1、对于CD45这种分群很明显的我可以直接如下图所示圈门

CD45圈门

但对于分群不明显的，表达高的，如CD3该怎么圈门？

CD3

以及分群不明显的，表达低的，如CD19、NK1.1，又该如何确定门的位置？

CD19圈门

     

NK1.1圈门

我自己目前圈门的策略是FSC-H\FSC-A 去粘连，FSC-A\SSA-A基本上全勾选（考虑到巨噬细胞），然后是死活，然后是CD45，各个细胞染色的门之前是根据BLANK（细胞只固定没染色）各个染料的阴性范围画的门，但是对于有些样本门是明显偏离了主群细胞的，所以我又每个样本靠着感觉画门，但这样的话就太主观了，希望老师们能给出建议。

2、我还有个问题就是，我重复了好几次，我的CD4+T淋巴细胞总是远远比CD8+淋巴细胞少，按理说CD4+T细胞应该比CD8+T细胞多才对，而且我查阅的文献也是皮下瘤中CD4+T细胞多，所以我就是不知道问题出在哪里，CD4用脾细胞单染分群明显是没问题的，但是染皮下瘤的时候总是染不出来，并且我在CD45阳性的细胞里直接看CD4+的细胞也很少，不知道是我消化的问题还是说这个抗体本身的问题

CD4CD8圈门

Reyna

niwanmao 发表于 2021-1-5 21:21
你的图片怎么用BASE64编码？这样显示不完整的。请编辑帖子，利用编辑器的工具栏上图片上传按钮上传吧。 ...

好的，谢谢倪老师提醒，我是直接截图后粘贴的，现在重新上传！

Reyna

niwanmao 发表于 2021-1-6 08:11
1、有没有试过通过CD3、CD19、NK1.1、CD11b等标记的反设门，来确定CD45的位置。看这里的CD19、CD3都没有明 ...

好的，谢谢倪老师的指导，我后面再优化一下处理条件！

Reyna

@niwanmao 感谢倪老师的回复，我用了CD3、CD19、NK1.1来看CD45的位置，发现有的样本之前CD45是有些没圈进去，而且FSC/SSC我也圈大了，但再仔细看这些目标细胞的位置不在CD45单独分出来的那个群，而在肿瘤实体细胞那个大群中，而且我的CD4更明显，还出现了双阳性细胞，反向圈门后看到这群双阳性细胞也是主要集中在实体细胞群，那我圈CD45究竟是按现在这样两群都圈还是说只圈分出去的那群细胞呢？

Reyna

gaocx 发表于 2021-1-6 14:31
我这里看的就不完整，显示有隐藏信息，需要回复后才能查看

之前把内容隐藏了，现在可以了！

Reyna

@niwanmao 倪老师，我把荧光图改成了CD45和CD3、CD19、NK1.1的两两组合的散点图，您看下有什么问题么？

Reyna

niwanmao 发表于 2021-1-7 07:40
我看这里的图都是以单参数+SSC或FSC显示，能否改成各荧光抗体的两两组合的散点图，看一下相互之间的补偿 ...

倪老师，我把CD45和其他的几个两两组合了看，您看看我上传的图片里是有明显的非特异性粘连么？

Reyna

niwanmao 发表于 2021-1-9 09:25
看起来确实CD45-特别多，CD45+部分几乎都是T细胞。应该还可以的，后续的优化减少CD45-部分的碎片。 ...

倪老师，减少CD45-的碎片是不是就是说注意标本的消化时间，勿消化过度？还有就是倪老师，我CD4和CD8的比例很奇怪，之前您也说过可能CD4是因为消化过度所以比例很少，那这部分数据我还能用来比较各组CD8细胞的差异吗？