淋巴细胞亚群流式细胞术计数已成为临床免疫学和血液学的必备工具。该技术为诊断和监测影响免疫系统的各种情况提供了关键信息，包括 HIV 感染、血液恶性肿瘤和移植后免疫重建。

随着淋巴细胞亚群计数的临床重要性的增加，对标准化方案和质量控制措施的需求也随之增加。为了满足这一需求，1996年在 Benelux国家（比利时、荷兰、卢森堡）建立了流式细胞淋巴细胞免疫表型分析的外部质量评估 (EQA) 方案。

Levering 等人的这项研究审查该 EQA 项目的10年数据，包括向参与实验室发送的20份半年报告，确定了影响测定结果的关键方法学因素，并评价 EQA 项目是否有效地减少了实验室间变异随时间的变化。通过分析这个数据集，有助于提高临床实验室淋巴细胞亚群计数标准化和可靠性。

材料和方法

样品制备和分发
EQA 项目在20次半年发送中分发了80份外周血样本。大多数样本（75份）来自各种血液学和免疫学疾病患者，而5份来自健康供者。

将样本分成约1.5 mL等份，并连夜运送至参与实验室。指导每个实验室使用其常规方案进行淋巴细胞亚群计数，并提供关于其方法的详细信息。

流式细胞术方法
要求受试者计数以下淋巴细胞亚群：
1. CD3 + T细胞
2. CD4 + T细胞
3. CD8 + T细胞
4. CD19 + B细胞
5. CD3-CD56 + NK细胞

分析了几种方法学变量对测定结果的影响：

1、设门策略：
a）FSC-SSC：使用前向和侧向散射的传统方法
b）CD45-CD14：使用 CD45 和 CD14 表达的“反向设门”方法
c）CD45-SSC：CD45bright、SSClow细胞上的设门
d）SSC-CD45-CD3：选择CD45bright、SSClow、CD3 + 细胞的“双锚”方法
e）T设门：针对 BD FACSCount 系统

2、平台方法：
a）双平台：结合流式细胞术百分比和血细胞分析仪的绝对计数
b）单平台：在流式细胞仪上使用体积或微球法直接绝对计数

3、样品制备：
a）裂解并洗涤
b）裂解不洗涤
c）不裂解不洗涤
d）单个核细胞分离

数据分析
采用了稳健的多变量回归分析来评价方法学变量对测定结果的影响。分析重点关注淋巴细胞亚群绝对计数的系统差异（偏倚）和实验室间变异性（变异）。

结果
对淋巴细胞亚群计数影响的几个关键结果：
平台方法
与双平台检测相比，单平台检测通常CD4+ 和CD8+ T细胞绝对数较低。这种差异强调了在解释不同实验室或研究的结果时考虑计数法的重要性。

样本制备
与使用红细胞裂解技术的试验相比，基于单个核细胞分离产生的T细胞绝对数较低。这一发现表明，分离过程中的细胞丢失可能导致T细胞偏少。

设门策略
设门策略的选择显著影响细胞计数结果。值得注意的是，与使用 CD45 和 CD14 的“反向设门”方法相比，基于CD45和侧向散射 (SSC) 的淋巴细胞设门策略产生了更高的CD4+ T细胞计数。这强调了设门在确定最终细胞计数和需要标准化设门方案中的关键作用。

样本稳定
与非稳定样本相比，稳定样本通常与淋巴细胞亚群计数较高。这一发现强调了样本稳定在运输和储存过程中维持细胞完整性的重要性，特别是对于 EQA 项目。

实验室特定效应
结果的显著偏倚和变异性与单个实验室相关，与分析的方法学变量无关。这表明实验室特定因素，如操作员经验或仪器校准，在测定结果中起着至关重要的作用。

时间趋势
在10年研究期间，结果变异呈下降趋势。然而，这一趋势仅对B细胞绝对数具有统计学意义。其他细胞亚群变异性的有限改善可能归因于参与实验室方案的不完全标准化。

参与者使用的设门方法也随时间而变化，下表显示的是参与实验室的设门策略随时间的分布：



这张图证明了随着时间的推移，设门策略发生了明显的转变，FSC-SSC设门的使用减少，像 CD45-SSC 和 SSC-CD45-CD3 设门这样更先进的设门技术增加。然而，在整个研究期间多种设门策略的持续存在，突出了方法标准化仍然任重道远。

作者还指出，尽管在每次发送后提供了建议，但参与者仅倾向于标准化他们的技术，主要是在样本制备和设门策略方面，但不太倾向于采用标准化绝对计数技术。这种不完全标准化可以解释实验室之间结果变异随时间只有部分降低的原因。

总之，对10年 EQA 数据的综合分析为流式细胞淋巴细胞亚群计数的影响因素提供了有价值的结果，强调了标准化方案的重要性，特别是在设门策略和绝对计数法，对于提高实验室间可比性很重要。虽然在降低试验变异性方面取得了一些进展，但临床流式细胞术标准化工作仍需持续。

参考文献：Levering, W.H.B.M., van Wieringen, W.N., Kraan, J., van Beers, W.A.M., Sintnicolaas, K., van Rhenen, D.J. and Gratama, J.W. (2008), Flow cytometric lymphocyte subset enumeration: 10 years of external quality assessment in the Benelux countries†. Cytometry, 74B: 79-90. https://doi.org/10.1002/cyto.b.20370