由结核分枝杆菌（Mtb）引起的肺结核（TB）仍然是全球重大的健康问题。据估计，约有17亿人携带潜伏性Mtb感染（LTBI），但有一部分接触Mtb的人，被称为“抵抗者”（RSTR），尽管临床测试如结核菌素皮肤试验（TST）和干扰素-γ释放试验（IGRA）结果始终为阴性，但他们的T细胞对Mtb特异性抗原有反应。

Sun等人比较了RSTR与LTBI个体中Mtb特异性CD4+ T细胞的独特功能。研究者推测，RSTR可能通过启动独特的适应性免疫反应，在暴露于Mtb后成功控制感染。作者通过先进的流式细胞术和转录组学技术，识别与细菌控制和抗Mtb感染相关的T细胞生物标志物，对于理解Mtb感染的早期事件以及开发新的TB预防和治疗策略具有重要意义。

材料与方法
1、低暴露群体：
- 参与者：17名TST-IGRA-和19名TST+IGRA+（LTBI）个体，来自乌干达坎帕拉
- PBMC分离与刺激：分离外周血单核细胞（PBMCs），并用针对Mtb特异性蛋白ESAT6和CFP10的肽池刺激6小时
- 细胞内细胞因子染色（ICS）：对细胞表面标志物（CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7）和细胞内细胞因子（IFN-γ, IL-2, IL-4/IL-5/IL-13, IL-17A, TNF）进行染色
- 额外标志物：评估CD107a和CD154以确定激活状态和记忆状态
- 数据分析：使用COMPASS（抗原特异性T细胞亚群的组合多功能性分析）识别功能T细胞谱

2、家庭接触群体（发现阶段）：
- 参与者：3名RSTR和4名LTBI个体
- PBMC刺激：用ESAT6/CFP10刺激6小时
- 指标分选：使用BD FACSAria III分选CD69+CD154+和CD69+CD137+ T细胞
- 单细胞多靶点转录组学：对分选细胞进行分析
- 额外标志物测量：CD4, CD8, CD45RA, CD127, CD25, HLA-DR, CD38
- SELECT-seq：应用于克隆扩增的活化T细胞进行全转录组分析
- FlowSOM聚类：用于识别19种ESAT6/CFP10特异性CD4+ T细胞亚群
- 可视化：生成t-SNE图以可视化细胞亚群分布

3、验证群体：
- 参与者：18名RSTR和20名LTBI个体
- PBMC刺激：用ESAT6/CFP10或全Mtb裂解物刺激12小时
- 评估标志物：CD3, CD4, CD8, CD45RA, CCR7, CD69, CD154

4、CFSE增殖实验：
- PBMC染色：细胞用CFSE（羧基荧光素琥珀酰亚胺酯）标记
- 刺激：用ESAT6/CFP10或全Mtb裂解物过夜刺激
- 细胞分选：分选CD69+CD154+CCR7+CD45RA+CD45RO-淋巴细胞
- 培养：分选细胞培养7天
- 流式细胞术分析：通过CFSE稀释和表面标志物表达评估增殖和分化


研究结果
RSTR与LTBI个体之间T细胞反应存在以下差别：
1、低暴露人群中Mtb特异性IFN-γ-CD4+ T细胞的缺失：
- 在低暴露群体中，TST-IGRA-参与者对ESAT6/CFP10刺激未显示IFN-γ-或多功能IFN-γ+ T细胞反应。
- LTBI个体显示出IFN-γ-和多功能IFN-γ+ T细胞反应。
- 这表明在低暴露环境中，对ESAT6/CFP10的IFN-γ非依赖性T细胞反应不常见。



2、RSTR Mtb特异性CD4+ T细胞的独特表型：
- FlowSOM聚类识别出19种不同的ESAT6/CFP10特异性CD4+ T细胞亚群。
- 一些亚群，如RORC+IL17A+细胞，在RSTR中富集，而RORC+IFNG+GZMB+PERF+细胞在LTBI中更为丰富。
- 在RSTR和LTBI参与者中都观察到ESAT6/CFP10特异性CD4+ T细胞的克隆扩增，证实了回忆反应的存在。
- 在LTBI中，克隆扩增的CD4+ T细胞主要集中在IFNG+ TH1*亚群中，而在RSTR中，它们并未主导任何特定的T细胞亚群。

3、RSTR和LTBI Mtb特异性CD4+ T细胞的干细胞记忆T细胞（TSCM）表型：
- SELECT-seq分析显示，RSTR CD4+ T细胞中与T细胞活化（SASH3, TNFRSF4, IKZF1）和细胞膜受体（CCR7, ITGAL）相关的基因表达较高。
- RSTR细胞在与翻译、细胞间粘附、细胞迁移和线粒体电子传递相关的基因中富集。
- RSTR ESAT6/CFP10特异性CD4+ T细胞中TCF7、FOXP1和CCR7的表达较高，表明其具有较未分化、类似初始的表型。
- 流式细胞术验证显示，与LTBI相比，RSTR ESAT6/CFP10特异性CD4+ T细胞中初始样CD45RA+CCR7+CD4+ T细胞的比例趋势较高。


4、Mtb特异性TSCM细胞的增殖和分化：
- CFSE增殖实验显示，RSTR和LTBI中Mtb特异性TSCM细胞的比例相似。
- 在RSTR和LTBI中，Mtb裂解物特异性TSCM细胞更倾向于分化为CCR7+CD45RA-的中央记忆T细胞。



以下是RSTR和LTBI个体之间T细胞表型主要差异的表格总结：


这些发现表明，RSTR个体可能通过独特的CD4+ T细胞功能控制Mtb感染，其特征为较低的炎症反应和更倾向于干细胞样记忆表型。识别这些T细胞生物标志物为深入研究抗Mtb感染的机制和潜在的新型TB预防策略奠定了基础。

参考文献：Sun, M., Phan, J.M., Kieswetter, N.S. et al. Specific CD4+ T cell phenotypes associate with bacterial control in people who ‘resist’ infection with Mycobacterium tuberculosis. Nat Immunol (2024). https://doi.org/10.1038/s41590-024-01897-8