肿瘤微环境中浸润淋巴细胞在调控肿瘤进展及治疗响应方面发挥着核心作用。流式细胞术能够实现对这些肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行高效分析，对组成特征与功能状态进行剖析。这里仅介绍一些简单的入门步骤和方案、分析逻辑，需深入分析或更详细的内容，可参考相关专业文章的方法学部分。

样本制备
1、肿瘤组织解离：
- 收集肿瘤组织并将其机械解离成小块。
- 使用酶消化（如胶原酶、DNase）进一步将组织分解成单细胞悬液。
- 将悬液通过细胞筛（通常为40-70 μm）过滤，以去除碎片和细胞团。

2、细胞计数和活性评估：
- 使用血细胞计数板或自动化细胞计数仪进行细胞计数。
- 采用台盼蓝拒染或与流式细胞术死活染料评估细胞活性。

抗体组合选择
1、通用白细胞标记物：
- CD45：用于识别所有白细胞。

2、T细胞标记物：
- CD3：通用T细胞标记物。
- CD4：辅助T细胞。
- CD8：细胞毒性T细胞。
- CD25和FoxP3：调节性T细胞（Tregs）。

3、B细胞标记物：
- CD19或B220：B细胞。

4、髓系细胞标记物：
- CD11b：髓系细胞。
- F4/80：巨噬细胞。
- Ly6G：中性粒细胞。

5、活化和耗竭标记物：
- PD-1、CTLA-4、TIM-3和LAG-3：检查点抑制剂，指示T细胞耗竭。
- CD69、CD44和CD62L：活化标记物。

6、NK细胞标记物：
- NK1.1或CD49b（DX5）：自然杀伤（NK）细胞。

分析逻辑
活/死细胞鉴别：
- 使用活性染料排除分析中的死细胞。

白细胞识别：
- 对CD45+细胞进行设门以识别肿瘤内的白细胞。

谱系识别：
- 在CD45+群体中，使用CD3设门T细胞，CD19/B220设门B细胞，CD11b设门髓系细胞。

T细胞亚群：
- 从CD3+群体中，进一步对CD4+和CD8+设门以区分辅助T细胞和细胞毒性T细胞。
- 通过对CD4+CD25+FoxP3+设门识别调节性T细胞。

活化/耗竭状态：
- 在CD4+和CD8+群体中，评估活化标记物（如CD69、CD44）和耗竭标记物（如PD-1、CTLA-4）的表达。

髓系亚群：
- 从CD11b+群体中，使用F4/80识别巨噬细胞，Ly6G识别中性粒细胞。

进一步阅读：
- Flow Cytometric Identification of Tumor-Infiltrating Lymphocytes from Glioblastoma
- Multi-color Flow Cytometry for Comprehensive Analysis of the Tumor Immune Infiltrate in a Murine Model of Breast Cancer
- Frontiers | Flow cytometry quantification of tumor-infiltrating lymphocytes to predict the survival of patients with diffuse large B-cell lymphoma

老师，一般100ul检测样品，死活染料像DAPI以及PI加多少以及什么时间加呢？

柒先森 发表于 2024-8-26 17:13
老师，一般100ul检测样品，死活染料像DAPI以及PI加多少以及什么时间加呢？

上机前加，用量参见帖子：用PI、7-AAD、DAPI进行细胞死活鉴别
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4372-1-1.html
(出处: 流式中文网)

niwanmao 发表于 2024-8-26 20:34
上机前加，用量参见帖子：用PI、7-AAD、DAPI进行细胞死活鉴别
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4372- ...

好的，感谢老师，还有个问题，就是体外T细胞培养的时间周期有多长呢（体外培养多长时间不会影响T细胞的正常表型检测以及分化？），能否将分选后的T细胞进行体外培养扩增后进行冻存处理？

柒先森 发表于 2024-9-2 14:57
好的，感谢老师，还有个问题，就是体外T细胞培养的时间周期有多长呢（体外培养多长时间不会影响T细胞的正 ...

小鼠肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分离后的体外 T 细胞培养时间可根据具体的实验要求和研究目的而有所不同。不过，一般建议尽量缩短体外培养时间，以保持 T 细胞的正常表型和分化。

1. 短期培养： 为进行表型分析和功能测试，TIL 可进行短期培养，一般从几小时到 2-3 天不等。这种短期培养可使细胞从分离过程中恢复过来，并可立即用于分析或检测。

2. 长期培养： 如果目的是扩增 TIL，用于采纳性细胞疗法或其他需要大量细胞的应用，则可能需要更长的培养时间。然而，长期体外培养会导致 T 细胞表型、功能和分化发生变化。建议将培养时间限制在 2-3 周，以尽量减少这些变化。


可以在冷冻保存前对分选的 T 细胞进行体外培养和扩增
但是，低温保存过程本身会对 T 细胞的活力和功能产生一定影响。因此，建议优化冷冻保存方案，并在解冻后评估细胞质量，以确保其符合预期用途。