流式细胞术一直是生物医学研究的核心工具，尤其在研究细胞过程和亚细胞器方面有着重要作用。近年来，基于光片照明的流式细胞术取得了重要进展，特别是在高通量多亚细胞器成像研究中的应用。Kumar和Mondal等人在2024年10月11日发表在Sci Rep的文章中，设计并开发了一种全新的多色整合光片成像和流式细胞术系统（m-iLIFE）。该系统克服了传统流式细胞术在复杂性和分辨率上的限制，能够在流动细胞中实现多亚细胞器的同步成像。通过结合光片照明、微流控平台和双通道荧光检测，为生物医学研究提供了亚细胞器级别的分辨率。实时捕获多色图像并重建细胞的三维结构，在研究细胞凋亡、细胞代谢等动态生物过程以及药物筛选方面具有广泛的应用潜力。

m-iLIFE系统集成了三个主要子系统：光片照明、多通道微流控标本流动平台和多色检测系统。提供高分辨率的细胞多色成像，重点关注细胞内的亚细胞器（如溶酶体和线粒体）。


1、多色光片照明：

照明系统基于473 nm和532 nm的两束激光，这两束激光通过分光镜组合并扩展五倍，以填充圆柱透镜的后孔径。该设置生成了衍射极限的光片，非常适合亚细胞结构的成像。光片垂直于微流控流动平台布置，确保在细胞流动时进行逐层照明，从而减少光损伤并提高信噪比。

2、微流控样本流动平台：

微流控系统由Y型通道组成，专为处理直径约15微米的小型细胞群设计。标记了荧光染料的细胞在100 µm × 100 µm的通道内以不同速度流动，这些速度由流量泵在吸入模式下调控。通过层流确保细胞平稳移动，并通过光片进行照明。每个细胞在通过光片时大约拍摄五个平面。微流控平台使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）构建。

3、多色检测系统：

检测系统采用双通道宽视场光学设置。标记的亚细胞器（溶酶体和线粒体）发出的荧光与光片照明成90度角收集，并通过一系列滤光片去除背景噪声。荧光通过分光镜分成两个路径——一个用于检测Mitotracker Red FM，另一个用于检测Lysotracker Green。这使得能够同时检测多个亚细胞器。结果图像由高灵敏度的sCMOS相机捕获，相机在不同的检测芯片区域记录两组图像。

4、点扩散函数（PSF）表征：

PSF的表征是系统开发的关键步骤，它决定了光学系统的分辨率。研究人员使用直径为1微米的荧光纳米微球对PSF进行了测量，并评估了系统在不同流速下的表现。这允许校正由细胞在微流控通道中移动引起的运动模糊，确保成像的准确性。



作者在多个实验中对m-iLIFE系统进行了测试，重点是对标记了Mitotracker和Lysotracker的HeLa细胞进行高通量成像。主要目标是观察正常条件下及药物处理后的亚细胞器分布。

1、多色亚细胞器的同步成像：

系统成功捕捉了溶酶体和线粒体在HeLa细胞中流动时的多色图像。每个亚细胞器发出的荧光分别记录在不同的通道，并合并形成复合图像，展示其空间分布。系统表现出每分钟成像约800个细胞的能力，极大地提高了流式细胞术的效率。

图：使用m-iLIFE对HeLa细胞进行的光片断层成像



| 通道  | 标记的亚细胞器        | 荧光染料             | 发射波长（nm）     |
|-------|------------------------|----------------------|--------------------|
| 1     | 溶酶体                 | Lysotracker Green    | 525                |
| 2     | 线粒体                 | Mitotracker Red FM   | 644                |

这些断层图像提供了细胞内亚细胞器分布的详细视图，允许研究人员实时观察细胞内变化。系统的三维重建功能进一步加强了对亚细胞结构的分析。

2、亚细胞器的聚集和细胞凋亡：

在药物处理实验中，HeLa细胞暴露于不同浓度的长春新碱，这是一种已知可诱导细胞凋亡的化疗药物。实验持续24小时，系统清晰地捕捉到了亚细胞器在细胞膜上的聚集，这是细胞凋亡的标志。线粒体网络解体，溶酶体表现为离散的点状结构。在较高药物浓度（500 nM和1 µM）下，细胞在6小时内表现出凋亡，而在较低浓度（250 nM）下则需要12小时。

图：长春新碱诱导的HeLa细胞凋亡


| 时间（h） | 药物浓度（nM） | 线粒体完整性   | 溶酶体分布    |
|-----------|-----------------|----------------|----------------|
| 0         | 对照            | 完整            | 均匀           |
| 6         | 500             | 断裂            | 外周聚集       |
| 12        | 250             | 断裂            | 外周聚集       |

系统能够实时监测亚细胞器的行为，为药物在细胞层面上的作用机制提供了深入见解。

3、高通量和多通道能力：

m-iLIFE系统的另一项重要特色是其高通量处理能力，使其非常适合大规模研究。该系统能够同时处理多个通道，每个通道可以同时成像多个细胞。这一特点在药物筛选中尤为重要，因其需要分析大量细胞群体以确定统计学上的显著效果。

4、PSF表征与去卷积：

为确保高质量成像，研究人员在不同流速下对PSF进行了表征。正如预期的那样，随着流速增加，PSF变宽，导致运动模糊。然而，使用去卷积算法，研究人员能够校正这种模糊，生成清晰的图像。这对于确保亚细胞器及其他亚细胞结构的准确量化至关重要。



参考文献：Kumar, P., Mondal, P.P. Multicolor iLIFE (m-iLIFE) volume cytometry for high-throughput imaging of multiple organelles. Sci Rep 14, 23798 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-73667-3