单细胞分析技术在过去几十年中迅速发展，成像流式细胞术（IFC）结合了流式细胞术的高通量采样和显微镜图像分析，实现了基于细胞内分子分布和/或细胞形态的高通量、高内涵细胞分析。

IFC的概念可以追溯到20世纪80年代，但直到最近，技术限制才被克服，使得高通量、高维度分析成为可能。

IFC在检测细胞内蛋白质的凝聚或扩散、观察蛋白质共定位以及识别细胞周期的不同阶段等方面具有优势。

与传统流式细胞术相比，IFC的通量较低，数据量巨大，且数据分析技术尚不成熟。

1、传统技术：ImageStream
- 技术原理：ImageStream是第一台商业化的IFC设备，采用时间延迟积分电荷耦合器件（TDI-CCD）技术，能够在低荧光强度下成像流动的细胞。
- 应用：在细胞形态变化、白细胞分化、白血病诊断和血液质量评估等方面进行了广泛研究。
- 局限性：通量较低（最多5000细胞/秒），缺乏细胞分选功能，仅提供2D图像。



2、二维IFC
- 技术发展：多种2D IFC技术被报道和商业化，包括使用像素阵列传感器和单像素成像技术。
- 单像素成像：利用细胞流动引起的位移进行成像，减少了光学扫描的维度。
- 关键技术：

• 光学时间拉伸（OTS）显微镜：利用宽带近红外飞秒脉冲激光进行无扫描成像，成像速度可达40 MHz，实现了100,000细胞/秒的高通量IFC。
• 荧光成像使用射频标记发射（FIRE）：通过射频调制的激发光束进行单像素成像，实现了1 m/s流速下的无模糊成像，通量可达15,000事件/秒。
  
• 空间-时间变换IFC：利用简单的光学设置将细胞的空间信息转换为荧光信号的时间信息，成像速度为0.2 m/s，可扩展到明场成像、3D成像和高光谱成像。
• Ghost成像流式细胞术（Ghost Cytometry）：利用压缩感知概念进行单次单像素成像，通过机器学习模型进行无图像重建的分类，实现了10,000细胞/秒的通量。
  

3、三维IFC
- 必要性：3D成像在分析细胞的3D结构和共定位事件时至关重要，尤其是在深度方向上信息丢失会影响分析结果的情况下。
- 技术挑战：3D成像比2D成像更具挑战性，需要更高的分辨率和通量。
- 关键技术：

• 无相机3D IFC：通过在深度方向上扫描激发光束，实现了0.2 m/s流速下的3D成像，空间分辨率为约2 µm。
  
• 并行3D IFC：利用单物镜光片显微镜技术（斜面成像）和声波流体控制，实现了超过2000细胞/秒的高通量3D成像。
• FLITS（光流控光片成像与空间信息转换）：利用脉冲光片照明，实现了超过10 m/s流速下的3D成像，理论通量为1200细胞/秒。
• 光场流式细胞术：利用傅里叶光场显微镜技术，通过单次曝光捕获细胞的3D图像，但存在不同深度处空间分辨率不均匀的问题。
  

在成像流式细胞术（IFC）的领域里，我们常常需要在分辨率和通量之间找到一个平衡点。简单来说，如果我们想要更清晰的细胞图像，就得提高分辨率，那么我们能检测的细胞数量，也就是通量，就会相应减少。特别是3D IFC，它为了获取细胞的三维结构，通量通常不如2D IFC来得高。 当比较不同IFC技术的效率时，一个重要的指标就是分辨率和通量的乘积。这个乘积越接近我们检测设备的数据传输能力，说明这项技术越能充分利用设备的速度优势。

随着IFC技术的不断进步，数据分析成为了新的挑战。目前，无论是2D还是3D IFC，细胞分析的方法都还在不断完善中，还没有形成统一的标准。为了从细胞图像中挖掘出更有价值的信息，机器学习，尤其是卷积神经网络，成为了研究的热点。不过，要让这些模型能够准确地分析新的数据，避免出现过拟合的情况，就需要在训练模型时更加小心谨慎。，IFC数据的标准化和共享也变得越来越重要。这不仅可以帮助我们建立更大的数据集，还能提高分析结果的可靠性和准确性。

展望未来，IFC技术将朝着能够分析细胞团，比如类器官和器官样体的方向发展。这就需要3D成像技术能够穿透并清晰地显示那些相互遮挡的细胞。同时，像荧光寿命成像和定量相位成像这样的更高维度的成像技术，也将逐渐被应用到IFC中，为细胞分析提供更多的信息。

得益于光学和信息技术的不断发展，IFC已经从一个理论上的概念，变成了一个能够进行高通量、高内涵单细胞分析的强大工具。未来，IFC在临床诊断、生物医学产业和生命科学研究中的作用将越来越重要，有望成为生物医学研究和应用的重要支柱。



参考文献：Ugawa M, Ota S. Recent Technologies on 2D and 3D Imaging Flow Cytometry. Cells. 2024;13(24):2073. Published 2024 Dec 16. doi:10.3390/cells13242073IF: 6.0 Q2