流式细胞术是研究细胞表型和功能的利器，但实验成败的关键往往始于样品制备——尤其是从实体组织中分离出高质量的单细胞悬液。这一过程需要精准平衡酶消化效率与细胞活性，稍有不慎便可能导致数据失真。

我们从Reichard A, Asosingh K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 2019;95(2):219-226. doi:10.1002/cyto.a.23690  这篇文章中，整理出一些常见“雷区”。  


组织处理   
1. 组织清洗与切碎  

• 优选新鲜组织！冷冻保存（如-80°C）会导致细胞回收率下降54%。
• 使用手术刀或剪刀切碎组织，避免使用组织匀浆器（导致细胞存活率降低至53.7%）。
• 目的：增加表面积，促进酶与组织的充分接触。
  

2. 酶的选择与组合  

• 三大酶类：
• 基质降解酶：Dispase（靶向胶原IV和纤连蛋白）、Collagenase（分解胶原肽键）、Hyaluronidase（切割透明质酸）。
• 细胞连接酶：避免Trypsin（破坏膜蛋白），改用TrypLE（保留抗原完整性）。
• 辅助酶：DNase-I（降解游离DNA，防止聚集）+ EDTA（螯合金属离子，抑制细胞黏附）。
• 优化的商品化酶：Accutase（含蛋白酶、胶原酶和DNase活性）可提高细胞得率和抗原保留。
  

酶解与机械解离：时间与温度的精准控制  
1. 酶解条件  

• 温度：多数酶在37°C活性最高，但低温（如4°C）可减少细胞死亡，需延长孵育时间。
• 时间：过度消化（如5小时）导致存活率骤降至26.1%，而不足（20分钟）引起细胞聚集。
  

2. 机械辅助  

• 振荡解离：使用轨道摇床促进组织分散。
• 过滤：100 μm滤网去除未消化的组织块和聚集体。
  

单细胞悬液评估
1. 细胞活性检测  

• 台盼蓝染色：死细胞可染上，显微镜下直接计数（存活率需＞80%）。
• 流式验证：核酸染料区分完整细胞与碎片，活力染料（如碘化丙啶）定量死细胞比例。
  

2. 碎片与聚集体清除  

• 磁珠分选：使用Miltenyi或STEMCELL的相关试剂盒去除死细胞和碎片。
• 红细胞裂解：若样品残留红细胞，需统一处理所有样本以保持一致性。
  

从离心到材料选择的其它雷区
1. 离心参数  

• RCF而非RPM：活细胞推荐300-400 RCF，固定细胞可增至900 RCF。高速离心（如＞900 RCF）损伤细胞膜。
  

2. 材料与操作  

• 容器材质：聚丙烯管（减少细胞黏附）优于聚苯乙烯（表2）。
• 轻柔操作：避免涡旋（存活率降至40.3%），改用温和吹打。
  

3. 特殊实验需求  

• 磷酸化流式：添加磷酸酶抑制剂保护信号蛋白。
• RNA检测：RNase抑制剂防止RNA降解。
  

4.冷冻保存与固定

• 冷冻风险：冷冻组织细胞得率仅为新鲜的54%，存活率下降至33.6%。
• 固定策略：4%多聚甲醛轻度固定可稳定细胞，但可能改变抗原构象，需预实验验证。