一句话：把染色时间从常规的30-60分钟延长到16小时，或许可以显著提升实验的分辨率、降低设门偏差、节省抗体用量、降低组合成本，甚至减少批次差异。

众所周知，抗体与抗原的结合是可逆的非共价反应，既依赖于抗体的亲和力，也受限于抗原的表达水平、定位和可达性。在设计高参数组合时，实验室往往需要在荧光素亮度、抗体可用性与光谱叠加之间权衡妥协。但即便组合设计得再巧妙，如果染色条件千篇一律，弱表达抗原或低亲和力抗体往往会被“稀释”在背景噪音里，导致设门时无法准确区分阳性群体和阴性群体，进而影响下游分析。

传统短时间染色（如30分钟）对高表达、易达抗原尚可胜任，但面对弱表达标记（如某些细胞因子、转录因子），灵敏度常常不足，重复性也差。2022年Current Protocols上这个章节的核心就是要系统验证：延长抗体孵育时间能否让结合反应充分达到平衡，从而提高分辨率，减少抗体用量，降低成本，同时还能降低实验之间的变异性。


方法

表面染色、细胞内染色具体步骤有所不同，但大体流程如下：

• 细胞准备：每个样本用200万个细胞，使用 PBS + 2.5% FCS + 2 mM EDTA 作为 FACS buffer。
  

封闭：鼠源细胞用 2.4G2 抗 CD16/32 杂交瘤上清封闭30分钟；人源细胞用 Fc Block 封闭30分钟。
表面染色：加入按滴定浓度的荧光抗体，4°C孵育16小时（或对照30-60分钟）。
* 细胞内染色（如检测 IL-2）：刺激细胞后，表面染色 → 固定（如 2% 甲醛） → 破膜 → 在破膜液中加抗体过夜孵育 → 次日洗涤后上机分析。



过夜染色如何提升实验效果？
1、延长染色时间显著提高信号强度

研究团队以小鼠脾细胞表面染色CXCR5为例，比较了15分钟、30分钟、60分钟和16小时染色后的荧光强度（MFI）。结果显示，随着染色时间延长，同样的抗体浓度下，MFI显著提高；如果染色16小时，所需抗体用量可比30分钟染色时减少10倍，仍能获得相同水平的信号。



更具代表性的是在人调节性T细胞（Treg）检测。研究者比较了CD4+CD3+群体中，CD25和CD127标记30分钟与16小时的染色效果，过夜染色不仅显著提升了信号强度，还扩大了动态范围，使记忆T细胞（memory T cells）群体设门更清晰。



2、细胞内染色同样受益

过夜染色不仅对表面抗原有效，对于细胞内（甚至核内）蛋白，如细胞因子 IL-2 或转录因子 Foxp3，也同样显著提升了灵敏度。例如，研究者通过对刺激后小鼠脾细胞的破膜处理，发现过夜染色IL-2可以获得远高于30分钟染色的信号，而在未刺激对照中则无非特异性信号，显示特异性良好。



4、批次间变异显著减少

多参数实验往往需要多批样本积累数据，而批间变异是公认的难题。实验组用17色免疫分型组合对同一份人全血样品分别进行3次独立实验，比较了30分钟表面染色与16小时染色结果。结果显示：过夜染色不仅提高了某些难以分辨的标记（如 SIGLEC-8）的分辨率，还使实验之间的交叉熵距离显著降低，意味着批次效应几乎可忽略。


5、成本可节约约80%

或许最让科研经费紧张的实验室心动的，是过夜染色带来的成本效益：研究者对比了439个抗体的染色费用，发现1小时染色的单个抗体平均花费约£0.21，而过夜染色仅需£0.04。此外，一个包含23-50参数的组合，过夜染色比传统染色节约成本中位数高达£11.03/样本。


注意点

• 不同抗体、抗原对固定剂敏感度差异大。例如，Foxp3 检测用 Foxp3 Fix/Perm 效果最好，2%甲醛或True Nuclear Fix也适用，但仅用0.2%甲醛或未固定效果较差。
  

荧光团选择需注意：部分 Tandem 染料（如 Cy5）易与 Fc 受体结合，引起非特异性信号。浓度降低有助于减少这种影响。
活细胞过夜染色时需留意细胞活力：小鼠脾细胞可接受5%以内活力下降，但肠道组织消化后获得的单细胞则更脆弱，需结合固定处理。


对科研人员来说，或许花一晚时间等待，远比重复做无数次低分辨率实验划算得多。

1. 参考文献：
   
2. Whyte, C. E., Tumes, D. J., Liston, A., & Burton, O. T. (2022). Do more with less: Improving high parameter cytometry through overnight staining. Current Protocols, 2, e589. doi: 10.1002/cpz1.589

复制代码