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如果你曾用流式细胞术数过外周血里的调节T细胞（Treg），多半被同一张图折磨过：明明CD4⁺CD25⁺的门画好了，Foxp3的阳性群却忽高忽低，甚至同一管样本换个抗体就面目全非。2009年，美国Blood Systems Research Institute的Jacqueline Law团队在《Cytometry Part A》发表了一项看似“技术流”、实则关乎所有免疫实验室“身家性命”的研究——他们系统比较了6个克隆号的抗人Foxp3抗体与5种固定/破膜缓冲液进行搭配组合，给出了可重复的Treg检测最佳搭配。
一、为什么必须较真？——Treg的门，差1%就是天壤之别
CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg只占外周CD4⁺T细胞的1.5–4.5%。在移植免疫、感染或自身免疫病研究中，实验组与对照组往往只差零点几个百分点。如果抗体或缓冲液换一次就把2%变成5%，任何临床结论都会瞬间失真。早期文献里最常用的eBioscience PCH101克隆曾被质疑“非特异染色偏高”，于是研究者决定把市面上能买到的抗体和缓冲液全部拉出来做一次“盲评”。
二、实验设计：30种组合、10名供者、4步验证
1、抗体阵容
- FITC标记：PCH101、236A/E7（eBioscience）、3G3（Imgenex）、206D（BioLegend）
- Alexa488标记：150D（BioLegend）、259D/C7（BD Pharmingen）
2、固定/破膜缓冲液
- eBioscience Foxp3 Buffer Set
- Imgenex Foxp3 Flow Intracellular Staining Buffer（这个我没怎么听说过）
- BioLegend FOXP3 Fix/Perm Buffer Set
- BD Pharmingen Human Foxp3 Buffer Set
- Invitrogen Caltag Fix&Perm Kit（这个是很好的胞内染色破膜剂，在此只是以「非专用foxP3破膜剂」角色出演一个参照物，现在在Thermo旗下）
3、验证梯度
- 先用1名供者的冻存PBMC做30种组合初筛
- 再用10名健康供者的冻存PBMC验证可重复性
- 对其中4名供者做“新鲜 vs 冻存”配对测试
- 最后比较PCH101、259D/C7两株抗体在不同荧光素（FITC/Alexa488/PE/Alexa647）下的分辨力
三、流式步骤
请参照每个缓冲液品牌的官方protocol。
这里摘录最常用的eBioscience体系作为示例：
1、表面染色
- 1×10⁶ PBMC → 加LIVE/DEAD Aqua 10 min（4 °C避光）
- 加CD4-Alexa700、CD25-PE-Cy7、CD127-PE，20 min（4 °C避光）
- PBS洗2次
2、固定/破膜
- 加1 mL eBioscience Fix/Perm工作液，脉冲式涡旋震荡后60 min（4 °C避光）孵育
- 2 mL 1×Permeabilization Buffer洗2次
3、胞内染色
- 加Foxp3-FITC（或Alexa647）、CD152-APC、CD3-Pacific Blue，45 min（4 °C避光）
- 2 mL Perm Buffer洗2次 → 4% PFA固定 → 上机
4、仪器设置
- Rainbow Fluorescent Particles每日校准PMT电压
- 每个荧光素做单色补偿管，≥10,000事件
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