如何用流式检测FITC标记的真菌

zy21318302 · 发表于 2015-6-9 20:21:31

请教下各位，是否有做过FITC标记真菌或者细菌呢？标记后怎么用流式检测这个细菌的荧光强度呢？可否给个具体的操作？

niwanmao · 发表于 2015-6-9 22:12:11

你是用什么FITC标记的抗体来标记真菌和细菌呢？肯定有相关的标记吧。
需要根据你要标记的抗体或其它荧光标记物，才能确定步骤。

磊子-梦醒十分 · 发表于 2015-6-11 11:01:31

用FITC直接标记细菌的主要原理是利用FITC(异硫氰酸荧光素)上的N=C=S基团和蛋白质上游离的-NH2发生化学反应，而后在特定波长光源的激发下即可观测到荧光信号。细菌细胞膜表面有大量的各种蛋白质都可以跟FITC结合。具体有多大浓度标记你可以查查文献，应该有。

zy21318302 · 发表于 2015-6-11 16:23:16

如果流式具体操作的话，荧光怎么检测呢？比如怎么调节SSC,FSC？用的是log还是lin呢？

niwanmao · 发表于 2015-6-11 20:31:18

zy21318302 发表于 2015-6-11 16:23
如果流式具体操作的话，荧光怎么检测呢？比如怎么调节SSC,FSC？用的是log还是lin呢？ ...

具体操作还是要对着仪器，按照具体仪器具体操作。每个仪器的软件里面都有一个控制面板的。

磊子-梦醒十分 · 发表于 2015-6-12 13:51:03

zy21318302 发表于 2015-6-11 16:23
如果流式具体操作的话，荧光怎么检测呢？比如怎么调节SSC,FSC？用的是log还是lin呢？ ...

以真菌或细菌的大小，选择log就能调好捕获图。

zy21318302 · 发表于 2015-7-6 11:47:05

倪老师，这是我用FITC标记和未标记的图，标记的图中，出现了两个峰值，是因为部分真菌还未被标记上吗？

niwanmao · 发表于 2015-7-6 15:09:32

zy21318302 发表于 2015-7-6 11:47
倪老师，这是我用FITC标记和未标记的图，标记的图中，出现了两个峰值，是因为部分真菌还未被标记上吗？
...

你选择阳性峰，然后再看看这类真菌在FSC/SSC散点图上的分布。

chymanhz · 发表于 2015-7-6 16:24:58

一定要注意用后清洗，细菌很容易长的，弄脏管路。你用阳性反圈门就知道哪群是细菌了。我之前做的只有一团。直径和1um的beads差不多大小。我看你用的好像是calibur，可以用荧光触发。要不用FSC触发容易漏掉

zy21318302 · 发表于 2015-7-6 19:32:20

本帖最后由 zy21318302 于 2015-7-6 19:38 编辑

chymanhz 发表于 2015-7-6 16:24
一定要注意用后清洗，细菌很容易长的，弄脏管路。你用阳性反圈门就知道哪群是细菌了。我之前做的只有一团。 ...

我跑完之后都是再用漂白水跑半小时，去离子水再跑半小时，然后再按正常的步骤清洗的。”用FSC触发容易漏掉“这个FSC触发容易漏掉是什么意思啊，我流式也没做多久，还不是很清楚，您能稍微解释一下吗

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