小鼠脾脏、胸腺中T、B细胞占比不太对，请帮忙分析下原因

xbaizxyq

结果比例不太对。尤其是胸腺，只能跑出T细胞。帮忙看一下原因。操作及标记方法如下：

脾脏：
用MACS的小鼠脾脏解离试剂盒机械磨碎，eBioscience 公司的红细胞裂解液裂解后，重悬细胞至1*107，加eBioscience 的抗体进行荧光标记，分别为CD3-Percp,CD45R-PE, CD49b-FITC (T细胞亚群比例); CD3-Percp, CD4-FITC, CD8a-PE（T\B\NK 细胞比例）。结果如下：


血液：
取100ul肝素钠抗凝全血，用eBioscience 公司的抗体进行荧光标记，分别为CD3-Percp, CD45R-PE,CD49b-FITC (T细胞亚群比例);CD3-Percp, CD4-FITC, CD8a-PE （T\B\NK 细胞比例）。eBioscience 的红细胞裂解液裂解后，结果如下：


胸腺：
机械破碎小鼠胸腺，重悬细胞至1*107，加eBioscience 的抗体进行荧光标记，分别为CD3-Percp, CD45R-PE, CD49b-FITC (T细胞亚群比例); CD3-Percp, CD4-FITC, CD8a-PE （T\B\NK 细胞比例）。结果如下：

niwanmao

主要是外周血碎片太多，估计处理时出什么问题了，建议重复一下。组织标本还好吧。

xbaizxyq

niwanmao 发表于 2016-11-4 12:03
主要是外周血碎片太多，估计处理时出什么问题了，建议重复一下。组织标本还好吧。 ...

那是裂红的时候裂过头了吗？重复操作几次，结果都类似，又判断不出操作过程中哪里有问题。老师您看标记抗体选择有没有问题。我们用的是BD C6检测的。
还有一点，请问胸腺的结果特别奇怪，应该是没有红细胞碎片干扰的，但其B细胞含量很低，老师可以帮忙解释一下吗？谢谢

niwanmao

xbaizxyq 发表于 2016-11-7 16:17
那是裂红的时候裂过头了吗？重复操作几次，结果都类似，又判断不出操作过程中哪里有问题。老师您看标记抗 ...

如果是新鲜采血的话，很有可能是裂解液配方导致细胞被破坏？我建议你直接取一点血，加裂解液后，每2分钟上一次机器看看FSC和SSC改变，看看究竟是不是随着时间延长细胞越来越少、碎片越来越多？如果是的话，就可以确定是裂解液。如果没有，那得找其它处理因素了。

不过你的脾脏同样裂解似乎还好一些，有点奇怪，难道血比脾脏细胞还脆弱？

xbaizxyq

原血不加裂解液的流式图如下：

加裂解液后，随裂解时间，流逝图变化不太大，但细胞大小明显比原血小很多。

xbaizxyq

用的是eBioscience的商品化裂解液，有效成分是氯化铵。老师您看这正常吗

小憨

胸腺样本的补偿调了吗？

niwanmao

xbaizxyq 发表于 2016-11-8 16:46
用的是eBioscience的商品化裂解液，有效成分是氯化铵。老师您看这正常吗

为什么都没变化？小鼠的外周血也应该有三群细胞吧

xbaizxyq

小憨 发表于 2016-11-8 18:33
胸腺样本的补偿调了吗？

CD3调了，因为CD45R 和 CD49的单标也没跑出，所以没能调的了

xbaizxyq

niwanmao 发表于 2016-11-8 19:47
为什么都没变化？小鼠的外周血也应该有三群细胞吧

老师，那您觉得是取血时出现的问题吗？请问肝素钠溶液4度避光一般可以存放多久？我的肝素钠溶液有6个月了，会不会是它的问题？不过，抗凝血效果还挺好的。