如何用多参数流式同时检测四种中性粒细胞功能：吞噬、ROS生成、胞外域脱落和脱颗粒

niwanmao

中性粒细胞是控制入侵病原体的第一道防线，因此中性粒细胞绝对数和功能对于预防感染都至关重要。 有些患者（如包括糖尿病、肝硬化、慢性肉芽肿病和器官移植受者）尽管中性粒细胞计数正常或高于正常，但由于中性粒细胞功能的遗传或获得性缺陷而面临感染风险增加，所以确认中性粒细胞功能有助于解释为什么中性粒细胞在控制这些患者的病原体感染方面无效。目前已发现糖尿病患者存在中性粒细胞活性氧 (ROS) 产生、趋化性、吞噬作用和中性粒细胞募集减少，证实了患者更易感染的原因。

除了遗传和代谢原因外，许多治疗方法可能会产生意想不到的副作用，从而导致中性粒细胞功能障碍。 布鲁顿氏酪氨酸激酶 (Btk) 抑制剂（例如治疗慢性淋巴细胞白血病的主要药物依鲁替尼）会损害中性粒细胞功能。 接受依鲁替尼治疗的患者的中性粒细胞吞噬作用、ROS 生成和细胞因子生成减少，从而导致该患者群体中侵袭性曲霉菌病的发病率增加。

通过快速识别患有中性粒细胞功能障碍的患者，可以迅速采取干预措施来管理高危患者。

下图是中性粒细胞主要的6大功能：


迄今为止，对中性粒细胞功能检测仅限于两种功能：吞噬作用和氧化爆发。Timmer KD等人在2023年2月的Cells杂志上，设计了一个方案，可同时测量四种中性粒细胞功能：吞噬、ROS 生成、胞外域脱落和脱颗粒。

这些功能是中性粒细胞反应的主要特征。 **胞外域脱落**是一种经常被忽视的中性粒细胞功能，是指选择性蛋白酶对特定基序表面蛋白的切割，最常见的是解联蛋白和金属蛋白酶 (ADAM) 家族。 中性粒细胞表面（胞外域）的这些变化影响各种中性粒细胞活动，例如细胞间粘附和通过 L-选择素 (CD62L)的裂解滚动，通过 Fc 受体 CD16b的裂解进行调理素识别，通过肿瘤坏死因子 α (TNFα) 和 TNFα 受体的裂解发出信号，通过受体 TREM-1 的裂解触发中性粒细胞激活。 CD62L 在刺激后几分钟内迅速脱落，是中性粒细胞活化的经典早期指标，是测量胞外域脱落的理想标记。

脱颗粒是中性粒细胞的另一个关键功能。这些颗粒含有抗微生物剂，例如髓过氧化物酶 (MPO)、溶菌酶、乳铁蛋白、混合金属蛋白酶9和中性粒细胞弹性蛋白酶。 根据其含量和释放顺序分为：分泌囊泡、三级、二级和最后一级颗粒。 我们选择通过 CD66b 的表达来分析二级颗粒的释放。

下图是多参数流式同时检测4种中性粒细胞功能的流程示例和结果图。(A) 检测工作流程的示意图。 在添加 ROS 检测染料 DHR123 之前，中性粒细胞与细胞因子或药物一起孵育，并与表达 iRFP 的真菌病原体白色念珠菌共培养。 共孵育后，对中性粒细胞进行免疫染色以检测二次颗粒释放和胞外域脱落。 通过流式细胞术分析中性粒细胞的功能。  (B) 用于检测中性粒细胞功能的流式细胞仪逐级设门策略。 首先根据FSC和SSC圈选中性粒细胞，接着排除粘连体，最后，通过针对中性粒细胞特异性表面蛋白 CD66b 的表达设门来选择中性粒细胞（箭头表示顺序分析）。 所有功能门均使用FMO对照、染色、未刺激的样本进行设置。




Timmer KD, Floyd DJ, Scherer AK, Crossen AJ, Atallah J, Viens AL, Sykes DB, Mansour MK. Multiparametric Profiling of Neutrophil Function via a High-Throughput Flow Cytometry-Based Assay. Cells. 2023 Feb 25;12(5):743. doi: 10.3390/cells12050743. PMID: 36899878; PMCID: PMC10000770.

facetodog

这个题目可以改成“纯流式分析结果发7分SCI，套路学会了吗”

niwanmao

facetodog 发表于 2023-3-20 15:03
这个题目可以改成“纯流式分析结果发7分SCI，套路学会了吗”

哈哈，来来来，总结一下套路

jiaoxue

为什么CD66b圈出中性粒之后，又把其作为脱颗粒的指标呢

niwanmao

jiaoxue 发表于 2023-10-23 10:02
为什么CD66b圈出中性粒之后，又把其作为脱颗粒的指标呢

CD66b本身既是中性粒细胞标记，又是中性粒细胞脱颗粒的标记物，在中性粒细胞活化、脱颗粒时，CD66b会上调

Eniac

niwanmao 发表于 2023-10-24 08:16
CD66b本身既是中性粒细胞标记，又是中性粒细胞脱颗粒的标记物，在中性粒细胞活化、脱颗粒时，CD66b会上调 ...

老师，请问这篇文章圈中性粒和中性粒脱颗粒时，是先用CD66b+圈出中性粒，再圈CD66b高表达的，用以表示脱颗粒的中性粒细胞吗？如果是这样的话，请问高表达CD66b的门是以什么标准圈的？如果要比较实验组和对照组中性粒细胞的脱颗粒情况，是展示散点图、比较CD66b-hi门中细胞的比例高低，还是展示直方图，比较CD66b的median值的高低呢？