细菌染死活

wmj123456

各位老师，我的实验样本是细菌，染了PI，第一张FSC和SSC圈出主的细菌后，感觉是分了2群，请问有遇过这种情况的吗？

wxd

用正常培养的细菌，纯水（如果可以的话）清洗两次，做以下两组：
Blank：不处理，不染色。直接上机；
PI组：煮沸5min（或者其他可以杀死细菌，并保证细菌完整性的方法），染色PI，上机检测。
Blank组的目的是排除因药物处理导致产生的不溶性颗粒，并确定细菌在PE通道的荧光上限。
PI组的目的是排除细菌死亡导致的在FSC/SSC坐标中位置的偏移，并确定PI染色是否正常（正常情况下，这一组的细菌死亡率应该是接近100%），初步判断结果的准确性。
最后，凭借峰状图的偏移来判断细菌的死亡率是不准确的，因为可能会出现图片中的情况。

wmj123456

您好，这个是blank和PI组的流式图，没有用直方图，应该可以这样分析吧？我只是觉得为什么第一张FSC和SSC中，圈出的细菌好像是分成了2群，这个要怎么解释呀？

niwanmao

wmj123456 发表于 2023-6-12 09:15
您好，这个是blank和PI组的流式图，没有用直方图，应该可以这样分析吧？我只是觉得为什么第一张FSC和SSC中 ...

细菌死亡，细胞体积和颗粒度，应该是会发生变化的，分成多群是有可能的。

wxd

总体看一下这个实验，是所有组别都有分群，还是只有样品处理组有分群。如果是前者，可能是这个细菌本身的特性。如果是后者，有两种可能，一种是细菌死亡导致的细胞体积和颗粒度的变化，另一种是药物和培养基发生反应产生的颗粒。可以用SYBR Green I（稀释10000倍染色核酸的那种，染色细菌时，也稀释10000倍，37℃孵育30 min）染色，看一下分群的是不是细菌。

wmj123456

wxd 发表于 2023-6-12 13:56
总体看一下这个实验，是所有组别都有分群，还是只有样品处理组有分群。如果是前者，可能是这个细菌本身的特 ...

请问您有做过细菌实验中，荧光素酶催化荧光素的实验吗？我们是先用荧光素酶孵育细菌，然后以荧光素为底物，二者反应后会产生荧光。
然后第一张图细菌分成了2群，而且是SSC大的那一群有荧光，理论上是百分之百FITC阳性的。我有2个疑问，1为什么细菌分成了2群，对照组即只加细菌组也是分为了2群，是不同分裂时期导致的细菌内部的颗粒度不一样吗？2为什么fitc阳性信号没有百分之百，而且是SSC大的那一群是fitc阳性？

wxd

我没有做过类似的试验，但是看你的试验过程，有以下猜测：荧光素酶孵育细菌，应该用的是感受态或者不是正常状态的细菌，不同状态的细菌，就像倪老师说的，细胞体积和颗粒度，应该是会发生变化的。可能你用的感受态细菌纯度不好，导致一部分细菌（SSC大的那一群）摄入了荧光素酶，另一部分没有摄入，从而导致了后边的检测结果发生改变。可以试试换一批细菌试试。

司徒随风

wmj123456 发表于 2023-8-28 09:42
请问您有做过细菌实验中，荧光素酶催化荧光素的实验吗？我们是先用荧光素酶孵育细菌，然后以荧光素为底物 ...

从您上传的结果应该是FITC阳性的都是SSC大的细胞，并不能得出SSC大的那一群有荧光；您可以分别圈那两群细胞看看FITC的阳性情况。
然后细胞更复杂的表现出酶活性，按理来说是正常的；
按您的结果来看大概率如您预料的那样：不同分裂时期导致的细菌内部的颗粒度不一样