小鼠肿瘤浸润髓系免疫细胞圈门求教

三方土

最近我在做小鼠皮下瘤肿瘤浸润髓系免疫细胞的分析，肿瘤解离得到单细胞悬液后直接染色，在圈门时首先T细胞的位置比较明确，然后髓系细胞主要分布在T细胞右上方，左上方主要是肿瘤细胞和死细胞，左下角则主要是碎片。按照这个思路我圈了免疫细胞的大致位置，并且活细胞和CD45+细胞也的确在其中富集，如图1（左上是计数的beads，不是细胞）。
但是在尝试不同圈门方式后我发现，其实还有一些髓系细胞的FSC和SSC信号落在这个圈子之外。如图2，当我首先仅去除碎片时，死细胞的比例大幅增加，还出现了一部分FSC-A较小的CD45+细胞（因为CD45信号偏弱且FSC-A小于T细胞，所以认为不是真正的白细胞），之后我主要关注树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞/M-MDSC、中性粒细胞/G-MDSC，在圈到这些细胞后，我又回头看这些细胞的FSC-A和SSC-A信号，发现各群细胞在主群以外，还有小部分的FSC-A偏小，我觉得这些可能不是真正的髓系细胞，但也说不清楚为什么会有这些事件，如果去除这些事件，那么巨噬、单核、中性粒仍主要分布于T细胞右上方，但树突状细胞明显地多了一个FSC-A信号稍低的细胞群，且这群细胞没有向死细胞或碎片部分继续延伸的样子，所以觉得应该也算是DC？
因为肿瘤微环境比较恶劣，细胞组成也很复杂，所以各类细胞没法清楚地区分开我觉得也正常，总结起来我的问题主要是两个：
1是在根据荧光信号圈到髓系细胞群后，还可以去掉一些FSC和SSC信号较低的事件吗？
2是我看到的两群树突状细胞都是真正的树突状细胞吗？为什么它们的FSC信号为不同呢？诚心求教，欢迎各位老师指正。

niwanmao

两个问题其实是同一个。

如确定荧光是特异性的，那么即使FSC和SSC偏小，我建议都要圈，因为不排除细胞因为处理时凋亡而发生皱缩。

至少从DC的这群来看，这两群FSC略有不同的，都要圈的，不一定两个群体，而是处理或者其它原因影响到，必须DC还可以细分为CD11b+和CD11b-的。