凋亡检测求助

ccchen945

我是用的一种自带荧光材料进行干预，取的动物肺组织样本做FITCAnnexin V and PI流式。该材料是微米级别的很小，大概就是我图1中红色框住的部分（即P6）。
1、虽然P1是我的目的细胞，但是材料光谱和FITC有重叠，实验小白还是有点担心，想问下会不会影响我后面流式中的结果？
2、图2是我最后圈的门，因为这次没有进行细胞计数，每个管都染的5ul+5ul，我发现随着样本放置时间延长，前后十来分钟的样子，凋亡比例会增加很多，正常对照组也多，这是不是因为我细胞数目太少了？

闷油瓶

PI染色好像不能放置时间太长，上机前染上就行。

niwanmao

材料和细胞群体明显分开，就无需担心影响结果。

另外，PI在染死活细胞时是在上机前1分钟加入的，而在凋亡检测中，加入Binding Buffer后，两个染料都是需要孵育15分钟的，几乎所有的Protocol都是如此，时间到了之后，凋亡比例就基本上定下来了。

ccchen945

niwanmao 发表于 2023-7-8 17:20
材料和细胞群体明显分开，就无需担心影响结果。

另外，PI在染死活细胞时是在上机前1分钟加入的，而在凋亡 ...

谢谢老师。我染色是按说明书的要求在100ul的Buffer里孵育15min，然后再加400ul的Buffer，但是我发现结果很不稳定，同一个样本，第一次和第二次第三次上样的结果是逐渐递增的，并且对照组就有超过10%比例的凋亡了，不知道这个是我的细胞太少了，还是染色剂量太大了？

ccchen945

闷油瓶 发表于 2023-7-8 15:08
PI染色好像不能放置时间太长，上机前染上就行。

好的谢谢