Zombie Aqua染巨噬细胞不分群

高壮壮

    各位老师上午好，我最近在做PBMC在MSC条件下向巨噬细胞分化的实验。现在发现该实验中染料无法区分细胞死活的问题。因为最终流式实验中涉及到打孔固定，因此区分细胞死活的染料为Biolegend的 Zombie Aqua。实验前用其他细胞验证过Aqua有效性以及确定抗体滴度，以上实验均证明该染料是好用的并且最终选择的稀释比例为1：1000，每支流式管4×10e5个细胞加5μL Aqua稀释液。

   整个实验中涉及到M1的检测（无需打孔固定），M2的检测（需要打孔固定，且Aqua在打孔固定前染色），我两个实验中均出现了Aqua染色后细胞不分群的情况，细胞消化后经过计数仪计数确定活率为85%左右，所以里面一定是有死细胞的。
   还请各位老师帮我看看，能否有解决办法，谢谢
   下面是实验中M1和M2的neg、Aqua单阳以及实验管中的Aqua图。

niwanmao

之前用其它细胞验证的结果图如何？

高壮壮

niwanmao 发表于 2023-8-8 22:17
之前用其它细胞验证的结果图如何？

倪老师，您好，感谢您的回复。
之前用人源的NK细胞验证，Aqua稀释比例从1：1000至1：4000，发现稀释比例1：1000至1：1000范围内的细胞明显分群，最终选定Aqua染色的稀释比例为1：1000。
我这边在考虑是否因为巨噬细胞的单个细胞体积大于NK，所以死细胞泄露相同数量的氨基，巨噬细胞所需要的数量比NK要少很多，这个时候用适用于NK细胞滴度的抗体，可能不适用于巨噬细胞。（Biolegend代理商的技术认为死活染料的有效性只与样本状态有关，而与细胞大小无关）
由于我们诱导出的原代巨噬细胞数量稀少，以及过程中涉及到的试剂耗材成本，使得我无法用实验细胞来做抗体的滴度实验。
昨天我用了人源的CBMC（主要成份为髓系细胞）重新进行抗体的验证，Aqua的稀释比例为1：64、1：100、1：200、1：400，有分群，但1：400分群状态稍弱。
下图为NK细胞验证的结果

stem_cells

1:1000的稀释比例可能有点大，我们做Treg染色的时候，用的比例是1:250，效果挺好的。
C:\Users\MI\Desktop\0810C:\Users\MI\Desktop\0810

高壮壮

stem_cells 发表于 2023-8-10 10:25
1:1000的稀释比例可能有点大，我们做Treg染色的时候，用的比例是1:250，效果挺好的。
...

嗯嗯，我后面用CBMC重新验证的时候也发现了，1：200分群更加明显