凋亡Annexin V APC单染出现7aad阳性信号 怎么回事

italywinwin

各位老师好，想请教大家个问题。之前在实验室找到个武汉普诺赛的APC 7aad凋亡盒子，做了单染和一个样本管做测试，效果感觉还行，如下图所示：

这是第一次做时的APC单染，感觉还行

这是APC单染

第一次做7aad单染

这是7aad单染



另外发现诱导细胞凋亡组在FSC分成了两个群，圈了一下发现FSC偏小的群体Annexin V APC阳性信号较强，是凋亡细胞



而FSC较大的那个群体，显示为APC阴性信号，是活细胞。



由于那个武汉普诺赛的盒子已经过期快半年了，另外剩下的也不多了，所以我从biolegend购买了Annexin V APC和7aad，正式做了一次，却发现Annexin V APC异常，如下图所示


APC单染却出现了7aad的阳性信号，或者说，就算我把横轴往上移动、使得这团细胞不再算是“阳性信号”，但毕竟这二者不是平行，看起来十分怪异。于是我试着调了下补偿，如下图所示


以最小幅度0.2，发现细胞群体已经跑偏了，看来不是补偿的问题，与补偿无关




在FSC中再次圈门，可见FSC较小的那个分群仍然是凋亡细胞，和上次做的时候是一样的，只是这次不知道为啥这次做APC的阳性信号却明显地偏向于7aad。


难道是biolegend的试剂的问题嘛，可试剂能出什么样的问题才能导致这种奇怪的结果呢？想不通是怎么回事了，恳求各位老师指点，感谢！！

niwanmao

从你的数据看，可能是旧的电压不适合新试剂盒。从图形看，感觉应该降低PerCP电压，使得APC单染管的PerCP中位数能够缩到左边一些，给右侧留下一定的空间。从Biolegend官方的图来看，确实是存在蛮大的APC向PerCP渗漏的情况，所以到时候分析可以采用不规则门。

italywinwin

最底下那张图无关，手滑，请各位老师忽略。。。

italywinwin

感谢倪老师，我再做下测试:-D

italywinwin

niwanmao 发表于 2023-8-11 10:41
从你的数据看，可能是旧的电压不适合新试剂盒。从图形看，感觉应该降低PerCP电压，使得APC单染管的PerCP中 ...

对了倪老师，还想请教一下：之前我一直认为，APC是由红光激发，7aad是由蓝光激发，二者虽然在发射光谱接近，但如果流式细胞仪的激光是平行设计而不是共线设计的话，则二者之间相当于在完全不同的空间，所以不会存在任何补偿。然而我实际做的时候，发现APC和7aad之间貌似还是有一定程度的补偿。这是什么原因呢？是理想中的平行设计、各激光像管道那样各走各的，实际上却是各“管道”之间的独立性、密封性并没有想象中的那么好吗？

niwanmao

italywinwin 发表于 2023-8-15 11:39
对了倪老师，还想请教一下：之前我一直认为，APC是由红光激发，7aad是由蓝光激发，二者虽然在发射光谱接 ...

因为收集光信号反射镜或透镜，是一条路的。

italywinwin

niwanmao 发表于 2023-8-15 22:04
因为收集光信号反射镜或透镜，是一条路的。

原来如此，感谢