凋亡检测，发现某组别左上角象限的细胞急剧增多

italywinwin

各位老师好，我又来向大家请教了，其实还是上次用biolegend的APC单染往7aad方向偏的那次实验。这次的问题是，检测的其中一个组“siNC”，比起其他组，看上去细胞群往上平移了许多，这就导致左上角象限的细胞急剧增多，如下图所示：



而其他组的细胞凋亡十字门形态看上去还是正常的，如下图所示：


这些细胞原本是同一个细胞，是转染了NC、过表达、突变、干扰等，最终相当于变成了“6种细胞”，每种分为正常培养和加药，各自又设了3个复孔。之所以上次犹豫了一下没问这个问题，是觉得难道自己上机的时候真的手滑了、在测siNC的时候动了电压？？所以这个问题最终也没敢问。但昨天又做了一次，而且用的是biolegend和武汉普诺赛的两种APC 7aad试剂，然后发现这个siNC组居然还是一模一样的情况。

按道理来说，左上角的细胞应该是凋亡的比较彻底、已经破裂，或是操作时吹碎的裸核之类的核碎片，可是我所有样本都是一样的操作手法啊，怎么可能恰恰siNC组的这6个重复全部出现了这个情况呢？而且第二次又做了后，把试剂可能的原因也排除了。这些细胞转染的基因都有GFP，为了避免GFP的强烈干扰，所以没有选PE，而是选择了APC和7aad。这样的话应该就是这细胞本身的原因了，看上去是不是像这siNC组发出了能被7aad通道检测到的信号、才导致了这个siNC组的异常？这究竟是怎么回事呢？

niwanmao

下载了你的数据，发现：
1、FCS2.0格式，不利于分析。
2、竟然未获取GFP和其它空白通道？这是非常不利于排查原因的。尽管你从理论上排除了GFP的干扰，实际上光路设计并没有你想象的那么完美，所以实际获取时，是应该把所有通道信号都获取的。

italywinwin

niwanmao 发表于 2023-8-17 16:07
下载了你的数据，发现：
1、FCS2.0格式，不利于分析。
2、竟然未获取GFP和其它空白通道？这是非常不利于排 ...

谢谢倪老师！用2.0格式是负责仪器的老师嫌3.0文件会很大，不想耽误时间，所以一直给我们拷贝的是2.0的，这个2.0与3.0的差距很大嘛？大概是差在哪些地方了呢？以后我也让她给我们换成3.0。其实之前用PE试剂盒做的时候是勾选了FITC通道的，后续换成APC后就想象着肯定不会受到GFP影响了、所以就没勾选。您说的勾选其他所有空白通道真是个很好的建议，我之前完全没想到，的确非常有利于排查原因。那我下周再做一次

niwanmao

italywinwin 发表于 2023-8-17 16:48
谢谢倪老师！用2.0格式是负责仪器的老师嫌3.0文件会很大，不想耽误时间，所以一直给我们拷贝的是2.0的， ...

2.0和3.0大小不应该有差异。

空白通道需要勾的，而且配置中凡是有的通道，都建议勾上，宁可文件大。

italywinwin

好的👌🏻