M1/M2 derived from THP1 流式检测问题 求助

Junming

Hi，


最近正在做流式检测M1/M2巨噬细胞 （THP1细胞系），但是用了很多方法也做不出结果，所以想向大家求教。

我使用的流式染色抗体体系是AF700-CD11b, PE-CD86 （M1）, APC-CD206（M2），Human TruStain FcX，Zombie Aqua（biolegend）检测细胞存活率，PBS containing 5% FBS & 0.1% NaN3作为缓冲液。

步骤是先用Zombie Aqua （1:1000）常温孵育30mins，用1ml PBS洗涤两次 （离心：1600rpm，4oC，1.5ml ep管），FcX（5ul in 85ul）封闭细胞室温孵育10分钟，然后直接加三种抗体5ul 4oC孵育30mins。缓冲液洗涤两次后直接上机 （200ul 缓冲液重悬细胞后上机，机子是ACEA NovoCyte 3005）

我曾经使用过刮刀，accutase等方法收集细胞，但是 PE-CD86, APC-CD206的平均荧光值 （mean fluorescence intensity）接近于阴性对照组，单染管的阳性率也接近0，更说不上双阳性那些了。好消息是CD11b的阳性率都接近70～80%


有个想法是会不会0.1%的NaN3的问题（我配制体系是475ml PBS，25ml FBS，0.5g NaN3），因为查了资料说NaN3会抑制荧光强度。

做过同一批处理的qPCR和流式，qPCR显示M1M2有显著差异，但是流式却是negative结果。

求教，想看看大家的想法或者意见。

谢谢！

我是超人我怕啥

我之前也做过这个实验，但最后没有做出来，感觉是需要看THP-1有没有诱导成巨噬细胞，当时我做的时候镜下观察细胞形态是没有问题的，但是没有表达，另外CD206我是破膜染色得

Junming

我是超人我怕啥 发表于 2024-2-28 11:47
我之前也做过这个实验，但最后没有做出来，感觉是需要看THP-1有没有诱导成巨噬细胞，当时我做的时候镜下观 ...

谢谢你的回应。

我做过同批一次的qPCR实验检测M1/M2的基因水平上的biomakers，qPCR结果显示M1M2是成功诱导的，但是流式却做不出来，这使我比较郁闷。已经做了大概半年了。

niwanmao

叠氮钠不会影响，CD206是比较难做，你可以尝试不同的用量、不同的电压，看看能否跑出来，而且这个抗原分群本身就不好，所以最好结合CD86做CD206/CD86散点图更好，不要用CD206直方图。

Junming

niwanmao 发表于 2024-2-28 12:52
叠氮钠不会影响，CD206是比较难做，你可以尝试不同的用量、不同的电压，看看能否跑出来，而且这个抗原分群 ...

老师你好，谢谢老师的解题思路。

其实我可不可以理解成我的样本管中某些细胞的MFI是负值，导致了整体的MFI偏向于甚至接近于空白对照？

如果是这个问题的话，我是需要调节电压还是补偿？样品采集后就不能调节电压了，有什么挽救的方法呢？

然后根据老师的思路，我查看了下之前数据的CVS表格的数值，发现Blank组（空白对照）的PE-A（CD86）有负值，例如平均负值是-200，总的MFI是2w，但是样品管中的平均负值是-400，MFI却是2k。差值大约是10倍。这使我怀疑是不是我在流式体系中使用的某种试剂抑制了荧光强度？

niwanmao

Junming 发表于 2024-2-28 14:00
老师你好，谢谢老师的解题思路。

其实我可不可以理解成我的样本管中某些细胞的MFI是负值，导致了整体的M ...

这些结果说明当初电压没调节正确